美極梅奇酵母冷凍干燥復合保護劑的優化研究

孫康，李軍，張鳴宇，朱鳳妹，葛超，閻賀靜

(河北科技師范學院 食品科技學院，河北 秦皇島 066600)

冷凍干燥菌劑具有活性高、穩定性強以及能有效預防變質和污染細菌等優點[1-2]。為提高冷凍干燥過程中細胞的存活率，通常加入保護劑以提高細胞對外界壓力的抵抗力[3]。海藻糖、脫脂牛奶、蔗糖、乳糖、葡聚糖、麥芽糖、甘露醇、麥芽糊精、阿拉伯膠和淀粉等糖和碳水化合物以及蛋白質被廣泛應用于細胞的凍干過程[4]。但單一保護劑對細胞的保護作用非常有限，需要其他保護劑的協同作用來提高細胞的存活率[5]。因此，在細胞凍干過程中通常添加復合保護劑，以達到冷凍過程中對細胞更好的保護作用[6-7]。POLOMSKA等[8]研究發現，凍干假絲酵母時，采用脫脂奶粉、海藻糖和谷氨酸鈉作保護劑比僅使用脫脂奶粉作為保護劑酵母存活率提高了60%。

美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima，Mp)是一種常見的非釀酒酵母，普遍存在于成熟葡萄漿果表面和葡萄酒發酵初級階段[9]。Mp與釀酒酵母混菌發酵，具有降低葡萄酒酒精含量、增加甘油含量[10]、改善葡萄酒的風味和品質[11-12]、促進紅葡萄酒色澤穩定性[13]等良好釀造特性[14-15]。因此，其在果酒釀造中具有非常廣泛的應用前景。我國釀造菌劑的研發遠落后于國外相關研究，且國內果酒釀造菌劑主要依賴進口。所以，專一性菌劑的缺乏，是導致國內葡萄酒同質化問題嚴重、口感寡淡缺乏特色的關鍵。因此，開發高效菌劑是提升果酒風味和品質的關鍵，也是提升果蔬精加工產品附加值的重要手段。為了促進Mp發酵劑的商業化及推廣其廣泛應用，有必要開展高穩定性及高存活率Mp菌劑的制備方法和技術等相關研究。目前雖已有文獻報道了異常漢遜酵母(Hansenulaanormala)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)等少數非釀酒酵母冷凍干燥保護劑的研究[6,16]，并對保護劑的保護機理進行了初步探討，為非釀酒酵母冷凍干燥菌劑的開發提供了參考。但研究發現，不同物種甚至同一物種的不同菌株在真空冷凍干燥及其儲存期間表現出不同的行為[17]。因此，目前有關非釀酒酵母冷凍干燥菌劑及其保護劑的開發還需要開展廣泛的研究。同時，有關Mp菌劑的開發及其冷凍復合保護劑的研究還鮮見報道。

本研究采用Plackett-Burman試驗設計法篩選出對Mp冷凍干燥具有顯著保護作用的保護劑，結合最陡爬坡試驗和響應面分析法(response surface method,RSM)進一步優化保護劑復合配方，以期最大限度提高該酵母在冷凍干燥過程中的存活率，為未來實現Mp發酵劑工業化的制備和應用提供參考，也為其他酵母冷凍干燥保護劑的研究和開發提供一定的研究基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美極梅奇酵母(Mp 01)，由河北科技師范學院釀酒工程實驗室保藏。

YPD液體培養基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20，121 ℃滅菌20 min。

YEPD固體培養基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20、瓊脂 20，121 ℃滅菌20 min。

2．客戶平臺。在面向未來時，我們首先需要預知可能的威脅，也就是我們最大的競爭對手是誰？我們真正的競爭對手不是所謂的面授班，真正的競爭對手到現在真的是變成了抖音、快手，客戶每天花多長時間在快手、抖音上面？又會有多長時間花在“管院在線”上？面臨這種現狀，我們的在線學習平臺該怎么搞？在市場競爭中，超越對手的是質量服務。我們要繼續堅持產品定位的高端路線，堅持課件系統化、專業化，堅持精益管理、服務至上等理念，以一流的產品、服務引領市場，超越對手。

實驗根據Box-Benhnken模型的中心組合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6中Plackett-Burman、RSM進行試驗設計、數據分析及模型的建立，差異顯著性水平為0.01和0.05。

1.2 儀器與設備

FDU-1 200 EYELA真空冷凍干燥機，北京五洲東方科技發展有限公司；低溫離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SW-CJ 系列潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；數顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BS-2F數顯恒溫振蕩培養箱，金壇區水北科普實驗儀器廠。

課件顯示：通過抽簽選斜板，丁丁的波波球直接從接近直角的斜板上滾下來；當當的波波球在呈45度角的斜板上滾下來；鈴鈴的波波球在呈15度角的斜板上滾下來。結果出來后引起一番爭執。

1.3 實驗方法

1.3.1 美極梅奇酵母生長曲線及菌體收集時間的確定

菌種的活化：適量挑取斜面菌種接種于100 mL YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，得活化種子液，并用血球計數板計數。

將活化的酵母種子液以1.0×106CFU/mL 的接種量接入150 mL YPD培養基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養，每隔3 h取樣，測定其OD600值。以未接種的培養基為空白對照，以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制Mp 01生長曲線，每個樣品設置3個重復。

1.3.2 美極梅奇酵母菌液離心條件的確定

根據1.3.1確定的Mp 01生長曲線，在酵母減速生長末期及平衡期初期收集酵母菌體，通過考察不同離心力(2 184、2 852、3 610、4 457×g)及不同離心時間(3、5、10、15、20 min)對酵母收集率的影響，確定適宜離心轉速和離心時間。

1.3.3 酵母活菌計數方法

離心后收集菌泥，加入與離心菌液等體積的生理鹽水對菌體進行復溶。取離心前菌液及離心后菌泥用生理鹽水復溶后的菌液[17]，采用稀釋涂布法確定活菌數，存活率計算如公式(1)所示：

中國出口貿易的爆炸性增長，不僅與我國改革開放政策的制定有關，更與國際分工的演化有關，但不管哪個原因，最終都導致我國貿易順差額的逐年擴大。需要注意的是，盡管我國通過加工貿易獲得了大量的貿易順差，但該順差的大部分卻來自于從事加工貿易的外資企業，該順差中真正能夠為中國所用的部分甚至連一半都不到。因此，現行的貿易統計制度在測算一國貿易利益時，存在著一定的缺陷，一些學者也不斷嘗試改革現行的貿易統計制度，以更好地測算各國貿易利益分配的問題。

(1)

根據1.3.6的方法，進行Plackett-Burman(PB)試驗因素與水平設計[19,22]，考查以上6種冷凍保護劑成分(脫脂乳粉、谷氨酸鈉、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)中，對Mp 01冷凍干燥過程中的存活率具有顯著影響作用的因素，PB設計結果見表2，試驗結果見表3，各因素效應分析見表4。

在建筑的建造過程中，十分重視對建筑朝向的選擇，注重建筑物的采光情況，建筑物的不同朝向獲得的太陽輻射差異不同，需要利用BIM技術分析建筑物的朝向。例如，利用BIM能耗分析技術可以對比不同朝向方案的能耗情況，幫助建筑設計人員確定建筑的朝向情況，然后建立模型進行分析，將建筑模型轉化為建筑能量模型。

貴陽市南明區花果園片區，位于貴陽市中心區域，人流量大，車況復雜，為有效解決行人過街問題，需修建大量人行天橋，其中遵義中路與延安南路交叉口的B聯，由于上跨延安南路（寬45m）且道路兩側情況復雜，導致橋梁設計跨度為62.68mm，橋下凈空高6m，橋面長度和寬度分別為63.68m和6.0m，另外，在該天橋兩端，還需要設置兩道人行扶梯。該人行天橋結構安全等級為一級，地震設防烈度為Ⅵ度，設計荷載如下：橋面活荷載為3.5kN/m2，二期恒載均為3.2kN/m2；橋頂雨棚活載和恒載分別為0.5kN/m2、1.7kN/m2；風壓標準值為 0.4kN/m2。

1.3.4 冷凍干燥方法

將離心后的菌泥放入無菌凍存管中，菌泥與保護劑按1∶2的體積比混合，放入-80 ℃冰箱預凍4 h。提前開啟凍干機，待冷阱溫度達到-40 ℃時，將處理好的MP 01立即放入凍干機，真空凍干24 h。采用稀釋涂布法計算冷凍干燥前后的活菌數[18]，如公式(2)所示：

為保證SBS改性瀝青混合料拌和穩定性，本項目選用間歇式拌和機進行瀝青混合料的拌和，由于SBS改性瀝青黏度較普通基質瀝青高，因此在拌和SBS改性瀝青混合料時，一般會增加5～10s的拌和時間，以確保SBS改性瀝青能夠均勻裹覆在集料上。另一方面，由于SBS改性瀝青所需的拌和溫度較高，因此在實際施工過程中應嚴格控制瀝青混合料的拌和溫度，既要避免溫度過低影響路面鋪筑質量，另一方面還要防止溫度過高引起瀝青混合料老化。

(2)

式中：N3，凍干粉復溶后的活菌數；N4，初始活菌數。

1.3.5 不同保護劑對酵母存活率的影響

單因素試驗：選取海藻糖、蔗糖、乳糖、維生素C、谷氨酸鈉、甘氨酸、麥芽糖、脫脂乳粉、吐溫-80作為單一冷凍干燥保護劑，以上保護劑的濃度參照文獻報道[3,5,7-8]，分別設定質量分數為3%、5%、7%、9%、11%，以存活率作為檢測指標初步篩選凍干存活率積極影響作用比較顯著的因素和水平，進行Plackett-Burman(PB)試驗設計。試驗設計及結果見表1。

精密稱取同一批六棱菊藥材粉末1.0 g，精密稱定，共 6 份，按“1.3.5”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.2”項的條件測定，計算六棱菊橙皮苷平均含量為 0.782 3 mg／g，其 RSD 為 2.86%，小于 3%，表明該方法重復性良好。

1.3.6 Plackett-Burman試驗

根據1.3.5的試驗結果，確定保護劑種類，每個因素設置高、低2個水平，使用Design-Expert 8.0.6設計n=12的PB測試[19]，篩選對Mp 01存活率有顯著影響作用的保護劑成分。

2.6.1 復合保護劑響應面試驗結果

根據DU等[20]的方法，對Plackett-Burman試驗結果確定的顯著影響因素進行最陡爬坡試驗，分析對Mp 01凍干存活率具有顯著影響作用的因素，并進一步確定顯著影響因素的最佳水平范圍。

（2）健壯性。健壯性又稱魯棒性，是指軟件對于規范要求以外的輸入能夠判斷出這個輸入不符合規范要求，并能有合理的處理方式。軟件健壯性是一個比較模糊的概念，卻是非常重要的軟件外部量度標準。

危重患者營養支持治療中藥學監護模式的探索與實踐…………………………………………………… 周 欣等（19）：2684

根據1.3.6的實驗結果，采用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken Design(BBD)響應面分析，確定Mp 01最優凍干保護劑的配比[21]。

1.3.9 數據處理與統計分析

桑塔亞那有言：“生和死是無法挽回的，唯有享受其間的一段時光。死亡的黑暗背景對托出生命的光彩。”臨終關懷事業作為崇高的“晚霞工程”，不僅在一定程度上減輕病人和家屬的負擔，更重要的是，它體現了對人的尊嚴的維護，是社會發展的必然需要，而我們相信，中小城市的臨終關懷事業即使正在遭受重重阻礙，仍具有光明的發展前景，必定會在逐步的探索中取得長足進步。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；脫脂乳粉，山東億寶萊生物科技有限公司；谷氨酸鈉和海藻糖，河南萬邦實業有限公司；麥芽糖，成都市科龍化工試劑廠；蔗糖，天津市風船化學試劑科技有限公司；乳糖、甘氨酸、維生素C，上海源葉生物科技生物有限公司；吐溫-80，阿拉丁。

2 結果與分析

2.1 美極梅奇酵母生長曲線

由Mp 01的生長曲線可知(圖1)，在接入菌種后的0～6 h為酵母生長的遲滯期，9～18 h為酵母的對數生長期，21 h左右進入穩定期(平衡期)，菌體量逐漸達到最大值，綜合考慮菌齡和菌體量，本試驗在發酵的第24 h進行菌體收集。

圖1 美極梅奇酵母生長曲線Fig.1 Growth curve of M. pulcherrima

2.2 離心條件對美極梅奇酵母收集率的影響

將收集的Mp 01菌體在不同條件下進行離心，并計算Mp 01的收集率，結果如圖2所示。離心轉速和時間對菌體收集率有明顯影響，隨著轉速和時間的延長，離心收集率先增大再減小，在15 min時，收集率最高；20 min時降低，隨著時間的延長，離心力對酵母細胞的破壞影響增大，細胞死亡率增大，導致收集率下降。最終確定，2 852×g離心15 min，Mp 01的收集率最高為93.55%，為本試驗最佳離心條件。

圖2 美極梅奇酵母在不同離心力及 時間下的離心存活率Fig.2 Survival rate of M. pulcherrima under different centrifugal force and time

2.3 單一保護劑對美極梅奇酵母凍干存活率的影響

綜合文獻報道結果，優選9種物質(表1)作為Mp 01冷凍干燥過程中的單一保護劑。由表1數據可知，9種單一保護劑對Mp 01具有不同保護作用。其中脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種物質作為單一保護劑時，Mp 01的存活率相對較高，存活率最高分別能達到64.9%，76.88%，77.3%，80.7%，70.92%，70.8%。因此，選擇以上6種保護劑進行顯著影響因素分析。

表1 不同保護劑種類及濃度對美極梅奇酵母凍干存活率的影響 單位：%

2.4 Plackett-Burman試驗設計及顯著影響因素

式中：N1，沉淀復溶液中的活菌數；N2，初始活菌數。

對試驗結果進行效應分析(表4)，發現本次PB試驗模型的P值為0.044 0，說明此模型在0.05水平上足以擬合試驗數據。表4中麥芽糖、蔗糖和海藻糖的效應值均為正，說明對Mp 01存活率有顯著正作用，

表2 Plackett-Burman設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果 單位：%

表4 Plackett-Burman試驗設計各因素效應分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design

而其余因素作用效果不顯著(P>0.05)。因此，麥芽糖、蔗糖和海藻糖是對Mp 01冷凍過程中具有顯著保護作用的保護劑，需進一步確定這3種顯著因素的最佳添加水平和配比。

2.5 最陡爬坡試驗設計與結果

將表7中數據進行二次多元回歸擬合分析，獲得Mp 01的菌體存活率對麥芽糖、蔗糖和海藻糖的二元多項式回歸方程：

表5 最陡爬坡試驗設計及結果 單位：%

實驗結果表明，麥芽糖、蔗糖和海藻糖分別以13%、10%和14%(表5，試驗號5)進行配比時，對Mp 01的保護效果最好。因此，進一步將表5中的第5組試驗中的3因素及其水平確定為響應面優化研究的試驗中心組合。

2.6 響應面法優化美極梅奇酵母凍干復合保護劑配比

1.3.7 最陡爬坡試驗

根據最陡爬坡試驗結果(表5)，使用Design-Expert 8.0.6對麥芽糖、蔗糖和海藻糖進行三因素三水平響應面優化設計。響應面具體設計方案和試驗結果如表6所示，方差分析如表7所示。

本試驗利用最陡爬坡試驗，對顯著影響因素麥芽糖、蔗糖和海藻糖的濃度范圍和配比進行優化，以對Mp 01凍干過程達到最好的保護作用。最陡爬坡試驗設計中，3個因素的變化方向的效應均為正效應(表4)，因此最陡爬坡試驗設計中以上3因素的水平均為正向變化，從低值往上增加。具體結果見表5。

Y/%=93.35+3.71A+2.69B+2.00C-1.16AB-3.50AC-3.07BC-4.27A2-5.38B2-5.17C2

1.3.8 美極梅奇酵母凍干保護劑復合配方的優化試驗及驗證

以某種口徑火炮為研究對象，考慮到膛內時期身管后坐對發射過程的影響較小，為此簡化數值計算模型，不考慮身管后坐的影響，建立其彈炮耦合有限元模型有限元模型中。其中，彈帶與彈體之間采用面面綁定約束，裝藥與彈體，彈帶、彈丸定心部與身管接觸設置。彈帶擠進過程中會自身接觸，因此，彈帶采用自接觸設置，動摩擦系數為0.1。圖1為正常未磨損的身管內膛結構，圖2為試驗測得的身管內膛磨損曲線，圖3為根據圖2的磨損量建立的身管內膛磨損的有限元網格模型，圖4為彈帶有限元網格模型，圖5為彈炮耦合有限元網格模型。

由表7可知，P<0.000 1，說明此模型在α=0.01的水平上回歸顯著；失擬項P值為0.058 9>0.05，

表6 美極梅奇酵母菌存活條件優化Box-Benhnken 設計方案及結果 單位：%

表7 響應面試驗回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation

2.6.2 冷凍保護劑最優組合配方及驗證實驗

依據響應面優化設計，通過對回歸模型進行數學分析，得到的Mp 01最優凍干保護劑配方：麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L，在此條件下Mp 01存活率預測值為93.34%。將所得最優保護劑配方應用于Mp 01的冷凍干燥，重復3次，Mp 01的平均存活率為92.78%，與預測值相差0.56%。以上結果說明，由響應面試驗設計得到的數學模型準確可靠，得到的最佳凍干保護劑組合方案可行，在實際操作中具有指導意義。

洞庭湖所面臨的發展挑戰很大，對策和機制的設定需要落實，只有首先統一好一系列制度，才能聯動濕地旅游業的建設開發，才能具體落實行動。統一好管理與服務人員對生態經濟區濕地旅游業的管理服務能力，才能打造一個良好的景區的招牌。只有集結眾人力量去落實湖區環境的保護，才有濕地旅游業的發展。當洞庭湖區人民的生活不斷改善，問題都得到有效解決，人民才既能坐擁金山銀山、又能共享綠水青山，那時洞庭湖生態經濟區必然已是秀美富饒的新經濟增長狀態。

對企業基層黨建政工工作的人員，要嚴格選擇。首先要注重工作人員的綜合能力，需要黨建政工工作人員的政治思想覺悟高，同時自身的道德素養也要十分優秀，同時思想政治教育的能力也要強。通過對現有基層黨建工作人員進行有效培養，每年分層分批對黨務政工干部進行輪訓，增強他們的工作能力，鍛煉他們的專業素質，提升他們的工作熱情，使他們積極參與到基層黨建工作中。加強黨務政工干部與經營管理干部輪崗，注重從黨務政工干部中選拔培養經營管理干部，暢通黨務政工干部成長通道。

2.6.3 美極梅奇酵母發酵劑貯藏條件及穩定性測定

對Mp 01凍干菌劑貯藏條件進行研究，實驗結果見表8，確定貯藏條件后，對其穩定性進行持續觀察，結果見表9。

表8 美極梅奇酵母貯藏條件結果 單位：%

表9 美極梅奇酵母發酵劑貯藏穩定性檢驗結果Table 9 Result of M. pulcherrima starter storage stability test

通過對美極梅奇酵母菌劑貯藏條件的研究發現，凍干菌劑在-20 ℃條件下貯藏，其存活率遠高于室溫和4 ℃條件，對貯藏穩定性的研究發現，在-20 ℃條件下保存4個月仍具有較高的存活率(89.85%)，說明在此條件下貯藏凍干菌劑具有較好的穩定性。

3 結論與討論

酵母的代謝和生理特征存在種間和種內差異，現階段并沒有普遍而有效的方法用于酵母凍干過程的保護。因此，對于不同的酵母，有必要開展針對性的凍干工藝，并優化最佳保護劑的配方，以促進其商業生產和廣泛應用。本研究前期篩選出的美極梅奇酵母Mp 01具有纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶等多種水解酶活性，有利于提高水果果皮花色素苷及果皮中品種香氣成分的釋放，對果酒釀造過程中果酒的澄清及增香具有非常重要的影響作用。因此本研究開展了Mp 01冷凍干燥保護劑的優化研究，以期為該酵母的廣泛應用及Mp商業菌劑的制備提供研究基礎和方法學參考。首先通過評估9種單一保護劑對Mp 01冷凍干燥過程的保護作用，發現脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種保護劑對Mp 01具有較好保護作用，進一步通過Plackett-Burman試驗法，發現麥芽糖、蔗糖和海藻糖對Mp 01的保護作用最為顯著，最后通過最陡爬坡試驗和響應面法，確定了Mp 01冷凍干燥復合保護劑配方(麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L)，結果表明，Mp 01冷凍干燥后的平均存活率達到92.78%，比單一保護劑最高存活率提高了16%左右。

已有研究發現，糖醇類物質是酵母冷凍干燥過程中的有效保護劑[4]，本研究也驗證了這一結論。在本研究中，對Mp 01具有顯著保護作用的保護劑均為糖醇類。對二糖、多元醇、單糖、脫脂乳和其他有機分子提高微生物的穩定性的研究發現，干燥過程中碳水化合物通過形成玻璃態來提高細胞的穩定性[23]。例如：海藻糖由于玻璃態的形成，可以置換水與脂質和蛋白質形成的氫鍵，從而穩定了微生物的細胞膜，減輕冷凍干燥對細胞的損傷[3]。同時，本研究發現蔗糖是影響Mp 01凍干過程存活率的顯著影響因素之一，這與CARVALHO等[24]的研究結果一致，他們發現不能代謝的糖比代謝的糖更有效。N’GUESSAN等[25]也有類似的研究結果，在生產用于啤酒釀造的酵母發酵劑時發現，蔗糖是凍干過程中最好的保護劑。因此，結合本研究結果以及以上分析表明，海藻糖和蔗糖很有可能是非釀酒酵母尤其是Mp通用的效果良好的冷凍保護劑，后續需要開展更廣泛和深入的研究，已驗證以上推測。

一般來說，單一保護劑的作用是有限的，存在各自的缺點，但這些缺點可通過其他保護劑來彌補[5]，因此，復合保護劑的研究和開發，對于提高酵母凍干菌劑的穩定性和活性尤為重要。由于菌種之間存在種間和種內的差異性，同時不同類型的保護劑對不同種類細胞的存活率的影響不同，所以冷凍干燥中保護劑及其配方需要根據菌種進行特定篩選、優化和改善。目前，有關Mp 01貯存期間的存活率以及該菌株的存活動力學及其在果酒釀造中的應用評價試驗正在進行中，使用優化后的復合保護劑凍干的Mp 01，-20 ℃保藏30 d后，存活率為91.85%，保留了原存活率的99.51%，貯藏4個月后，仍具有較高的存活率(89.85%)，表現出較好的貯藏穩定性，說明此復合保護劑對Mp 01的低溫貯藏具有很好的保護作用。此外，該復合保護劑是否適用于其他Mp、釀酒酵母、其他非釀酒酵母及釀酒酵母和Mp混菌發酵菌的開發，需要進一步的研究和驗證。