白果殼纖維素對不同種類多酚的吸附行為及其動力學研究

吳晶晶，倪洋，李燕，綽爾鵬，弓玉紅，李進偉，范柳萍

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

多酚是在植物性食物中發現的具有潛在促進健康作用的化合物，也是近年來興起的天然抗氧化劑之一。流行病學研究發現，多酚在預防某些疾病(如心血管疾病、癌癥)和維持人類健康方面具有潛在益處，食用富含多酚的植物性食品與慢性病患病風險的降低之間可能存在關聯[1-2]。

已知天然多酚與各種大分子之間存在吸附行為[3]。一旦多酚接觸到植物的細胞壁類似物(如纖維素、纖維素/果膠)或植物細胞壁材料，二者之間的相互作用就會自發地、廣泛地發生[2]。一方面，多酚與植物細胞壁成分(尤其是膳食纖維)的結合可以顯著影響它從食物基質中的釋放，使其更具生物活性，更容易被人體胃腸道吸收[4-6]；另一方面，某些多酚與不溶性纖維素的結合增加了纖維素的抗氧化活性，當這種纖維素/酚復合顆粒作為水包油(oil/water, O/W)型Pickering乳液的穩定劑時，能夠將多酚錨定在油水界面，進而延緩乳液內油脂的氧化，這對食品加工是有利的[7-11]?；谝陨系膬瀯?，越來越多的人開始研究纖維素對多酚的吸附行為和復合顆粒對多酚的生物可及性、加工利用度的影響。PHAN等[2]報道，經選擇的多酚對不同的纖維素基復合材料和蘋果細胞壁具有選擇性的結合現象。LI等[3]制備了茶多酚改性細菌纖維素(bacterial cellulose, BC)納米纖維，并將它作為界面抗氧化劑和膠體表面活性劑穩定Pickering乳液。結果表明，改性納米纖維在油水界面上具有良好的自由基清除活性。盡管酚類物質與植物細胞壁材料、純纖維素和纖維素/果膠模型之間的相互作用已經日漸清晰，但是對不同種類多酚與纖維素之間的結合行為和不同種類植物細胞壁中的纖維素與多酚的結合行為仍然知之甚少。

白果殼纖維素是一種還未被深入研究的多酚目標結合物。酸水解和高壓均質(high pressure homogenization, HPH)處理能改變其光學性質和物理性質，使之成為納米級纖維素顆粒[12]。本實驗對白果殼納米纖維素進行孔性能表征，并選取5種常見的多酚，探究其對不同種類多酚的吸附行為，研究離子強度、pH、溫度3種環境因素對多酚吸附的影響，表征纖維素吸附多酚前后的表面化學結構變化，考察纖維素/酚復合顆粒的自由基清除能力。研究結果可為進一步探究其他植物細胞壁多糖和整個細胞壁系統對不同種類多酚的吸附行為及動力學提供參考依據，同時為制備一種能夠在油水界面抑制油脂氧化的乳液穩定劑提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

白果，去除果仁得到白果殼，江蘇泰州；氫氧化鈉、亞氯酸鈉、乙酸、硫酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；兒茶素、茶多酚、沒食子酸、阿魏酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 白果殼納米纖維素的制備

按照NI等[12]的方法對白果殼進行純化處理。將粉碎的白果殼和4%的NaOH溶液按照料液比1∶25(g∶mL)混合，在90 ℃水浴下加熱2 h，隨后過濾去除NaOH溶液，用去離子水洗滌。此過程重復2次，在50 ℃條件下熱風干燥。隨后將干燥的纖維素按照料液比1∶25(g∶mL)與漂洗液(每100 mL漂洗液中含有1.5 g亞氯酸鈉，2.5 g NaOH和8 mL乙酸)混合，在80 ℃水浴下加熱2 h，過濾去除漂洗液。此過程重復2次，用去離子水反復清洗至纖維素懸浮液的pH至中性。

純化后的纖維素，采用62%的硫酸按照1∶15(g∶mL)料液比在45 ℃下水解30 min，水解結束后立即終止反應，用去離子水進行透析去除多余的無機鹽離子。透析結束后，采用高壓均質(30 MPa，循環2次)制備得到納米纖維素顆粒。

1.3 白果殼納米纖維素對酚的吸附行為

1.3.1 酚在纖維素上的吸附動力學研究

為了探究白果殼纖維素對不同酚的吸附情況，選擇兒茶素、茶多酚、沒食子酸、阿魏酸和EGCG作為研究對象。纖維素和酚的自發吸附實驗參照LIU等[13]的方法做了一定的修改。稱取1.0 g纖維素粉末倒入250 mL錐形瓶中，隨后加入100 mL(200 mg/L) pH 7.0的酚溶液，將錐形瓶放入轉速150 r/min和溫度37 ℃的搖床中。在吸附時間分別為1、5、10、20、30、60、120、240、480、600、1 000、1 440 min時，用注射器吸取1 mL的上清液，用0.22 μm濾膜過濾，隨后測定濾液的吸光值。纖維素吸附酚的量用Qt(mg/g纖維素)表示，Qt計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ0和ρt分別為水相中起始酚的質量濃度和t時刻酚的質量濃度，mg/L;V,溶液體積，L；m，纖維素的質量，g。

此外，利用一級(公式2)和二級(公式3)模型對實驗數據進行擬合，以評價纖維素對5種酚類物質的吸附能力。采用Weber-Morris顆粒間擴散模型(公式4)描述吸附過程：

ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t

(2)

t/Qt=1/k2(Qe)2+t/Qe

(3)

Qt=kit1/2+C

(4)

式中：Qt為不同時間t的吸附量；Qe為平衡吸附量；k1(1/min)，k2[g/(mg·min)]和ki[(min1/2·mg)/g]分別是準一級，準二級和Weber-Morris粒子間擴散模型的速率常數。

1.3.2 環境對酚吸附的影響

(1)離子強度的影響。以兒茶素為研究對象，吸附實驗按照1.3.1的方法，通過加入NaCl來調節酚溶液的離子強度，使得最終酚溶液的離子強度分別為0、50和100 mmol/L。

(2)pH的影響。以兒茶素為研究對象，吸附實驗按照1.3.1的方法，用磷酸緩沖液將酚溶液的pH分別調節為2.0、5.0和7.0。

(3)溫度的影響。以兒茶素為研究對象，吸附實驗按照1.3.1的方法，將搖床的溫度分別調節為4、25、37 ℃。

1.4 纖維素顆粒的孔性能表征

使用氮氣吸附儀(Autosorb-IQ，Quantachrome公司，美國)對纖維素樣品進行孔性能表征。5 g樣品在60 ℃和10-3mmHg下進行脫氣直到平衡。在-196 ℃下進行N2的吸附-脫附過程測試。比表面積根據Brunauer-Emmett-Teller(BET)分析方法計算。

1.5 纖維素吸附多酚前后的表面化學結構變化

使用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)對樣品表面化學結構進行分析，選取純纖維素以及纖維素吸附兒茶素的樣品。測試條件為XPS(Thermo ESCALAB 250，美國)的X射線激發源為單色Al Ka(Hv=1 486.6 eV)，功率150 W，X射線束斑500 μm，能量分析器固定透過能為20 eV。

1.6 纖維素/酚復合顆粒的自由基清除力

配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，取一定體積的樣品懸浮液(2 mg/mL)用DPPH乙醇溶液補足至4 mL，充分混合后，室溫避光反應30 min。反應結束后，在5 000×g離心2 min，測定上清液的吸光值，即為At。相同條件下，將去離子水代替樣品溶液作為對照，將無水乙醇代替DPPH乙醇溶液作為空白，在517 nm處的吸光值分別記為Ac和Ab。DPPH自由基清除率計算如公式(5)所示：

(5)

將7 mmol/L ABTS溶液和2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液按1∶1的體積比混合，在避光條件下靜置12 h，使用前用無水乙醇稀釋至溶液在734 nm波長下的吸光度為(0.70±0.02)，即為ABTS工作液。取一定體積上述樣品懸浮液，用ABTS工作液補足到4 mL，搖勻后避光放置10 min，在波長734 nm下測定樣品的吸光度，記為Ax管；在相同的條件下，用無水乙醇代替Ax管中ABTS工作液，記為Ax0管；用無水乙醇代替Ax管中的樣品溶液，記為A0管。ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(6)所示：

(6)

1.7 數據分析

各組實驗重復3次，采用SPSS 18.0進行統計分析，Origin 9.0軟件進行作圖處理。

2 結果與分析

2.1 纖維素對不同酚類的吸附

2.1.1 纖維素孔性能表征

通過氮氣吸脫附法研究纖維素的孔隙結構特征。由圖1-a可知，纖維素的吸脫附曲線符合Ⅰ型吸附-脫附等溫線[14]。另外，隨著相對壓力的增加，吸附N2的量逐漸增加，并且脫附曲線展現出H4型滯后環，屬于狹縫孔，這種現象常出現在微孔和中孔混合的吸附劑中[14-15]。由圖1-b可知，纖維素孔隙主要分布在1～30 nm，通過計算，樣品的比表面積為246.71 m2/g，孔體積為0.35 cm3/g。氮氣吸脫附法的結果說明了白果殼納米纖維素顆粒存在著良好的吸附行為。

a-吸脫附等溫線；b-孔徑分布圖1 納米纖維素氮氣吸脫附等溫線和孔徑分布Fig.1 N2 adsorption-desorption isotherm of nano cellulose and pore size distribution

2.1.2 多酚的自發吸附

5種酚類物質在白果殼纖維素上的吸附隨時間變化的情況如圖2所示。

a-不同種類多酚的吸附情況；b-一級動力學模型；c-二級動力學模型；d-Weber & Morris粒子內擴散圖圖2 酚類物質在白果殼纖維素上的吸附隨時間的變化Fig.2 Absorption behavior of polyphenols on gingko husk cellulose during absorption

隨著時間的增加，5種酚類的吸附量都在短時間內有不同程度的增加，最終的吸附量都穩定在0.5 mg/g纖維素以上。這說明白果殼纖維素對5種酚類物質均存在自發吸附行為。吸附理論顯示，如果天然化學成分在吸附劑上的吸附在幾分鐘至幾小時這樣相對較短的時間內達到平衡，表明這一過程可能是通過分子間作用力發生的[13]。

表1總結了動力學參數、相關系數和相對誤差。模型擬合結果表明，采用二級動力學模型時，5種多酚的實驗吸附容量(Qe，exp)均更接近計算值(Qe，cal)。這表明白果殼納米纖維素對不同種類多酚的吸附機制可能類似，纖維素對目標吸附物的選擇性較低[13]。這進一步證明了物理吸附過程的存在。

表1 不同酚在纖維素上吸附的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of adsorption of different polyphenols on cellulose

事實上，酚類物質對纖維素的自動吸附可能涉及到許多由氫鍵和疏水相互作用組合而成的低能非共價相互作用的建立[1]。PHAN等[1]發現，中性帶電荷的纖維素與帶負電荷的酚酸、帶正電荷的花青素和中性化合物(+/-)-兒茶素相互作用的速率和程度相當。PADAYACHEE等[16]也發現，紫色胡蘿卜汁中帶正電的花青素或帶負電的酚酸與細菌纖維素類似物之間存在程度相似的相互作用。上述結果都可以佐證這一觀點。

2.1.3 多酚的吸附過程

從圖2-a可知，纖維素吸附的酚量均呈先增加后不變的趨勢。具體為：在實驗開始后的25 min內吸附速度較快，多酚吸附量快速增加；25 min后，纖維素對5種酚類的吸附明顯放緩，雖仍有波動，但總體趨于平衡；1 000 min后，5種酚類的吸附量幾乎保持不變。Weber & Morris粒子內擴散模型已被用于完全定義吸附過程[13]。根據該模型，通過線性擬合將吸附過程分為2個部分，如圖2-d所示，在第一階段，纖維素對5種多酚的吸附量迅速上升；吸附由第一階段進入第二階段的時間集中在12.25～25 min左右；進入第二階段后，吸附速率明顯下降，擬合線斜率遠小于第一階段。這說明纖維素對酚的吸附過程存在快速、慢速和平衡3個階段。酚類吸附速度的前后變化與吸附原理有關：在初始階段，纖維素表面有足夠多的酚類物質結合位點，因此吸附速度快；隨后，由于吸附位點數的減少和酚類物質濃度降低，速率減慢，接近平衡[13](圖3)。LIU等[13]在研究兒茶素在纖維素表面的吸附現象時也發現了類似的速度變化情況。

圖3 纖維素對多酚的吸附過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the adsorption process of catechin onto cellulose

一般來說，分子從液相到固體吸附劑的吸附過程包括3個階段：膜擴散、顆粒內擴散和平衡，而Weber & Morris粒子內擴散模型擬合線沒有通過原點。這說明在吸附過程中，顆粒內擴散不是速率限制因素，由于纖維素晶體的非微孔結構，吸附主要發生在表面[13]。

2.1.4 纖維素對多酚的吸附量

縱向比較圖2-a或圖2-d中纖維素對5種酚類物質的吸附量，排序如下：兒茶素>茶多酚>EGCG>阿魏酸>沒食子酸。5種酚類物質中，白果殼納米纖維素對兒茶素的吸附能力最佳，吸附量可達3.7 mg/g纖維素；對沒食子酸吸附能力最差，吸附量僅有0.5 mg/g纖維素。圖2-b表征了不同種類多酚在吸附初期(0～30 min)的吸附速率?？梢钥闯?，在吸附初期，纖維素對茶多酚的吸附較快，而對兒茶素、沒食子酸的吸附則相對較慢。圖2-c表征了不同種類多酚在整個吸附過程(0～1 600 min)中的吸附速率，排序如下：兒茶素>茶多酚>EGCG>阿魏酸>沒食子酸。

以上現象說明，白果殼纖維素對不同種類酚類物質的吸附量和吸附速度有所差異。這可能是由于5種酚類物質間分子結構、分子質量存在差異。如果酚類物質的分子結構中有較多的芳香環，則它相比于其他酚類更容易與纖維素結合。這是因為分子結構中芳香基團和羥基的數目，或酚類化合物的天然電荷是酚類與纖維素之間形成非共價鍵和疏水相互作用的重要因素[1]。

2.2 環境對纖維素吸附兒茶素的影響

酚類物質與纖維素之間的自發相互作用主要受非共價相互作用的調控，包括氫鍵和疏水相互作用[17-19]，而這些非共價相互作用會受到體系pH、溫度和離子強度的影響[20]。因此，選取白果殼纖維素吸附量最大的兒茶素來探究離子強度、pH和溫度3種環境條件的改變對酚類物質吸附量的影響。

2.2.1 離子強度對吸附的影響

由圖4可知，當離子強度為50和100 mmol/L時，纖維素對兒茶素的吸附量無顯著性差異，而0 mmol/L的離子強度會使兒茶素的吸附量顯著低于另外2組。這說明外加一定的離子有利于多酚的吸附，而外加離子強度的大小對多酚吸附無顯著影響。這可能是因為纖維素聚合物的疏水區域與多酚分子結構中的疏水基團(如芳香環)之間建立了疏水相互作用，它能夠隨著離子強度的增加而增加[17]，所以外加一定離子能夠增加多酚的吸附量。PHAN等[20]在研究相同區間離子強度對阿魏酸、兒茶素和花青素-3-葡萄糖苷(Cya-3-glc)在BC上吸附情況的影響時得到了與本次實驗類似的結論。但是GAO等[21]發現，離子強度為0.05～0.5 mol/L時，燕麥β-葡聚糖對茶多酚的吸附量顯著減少，這與本實驗的結論不同，可能是因為本實驗中添加的NaCl量過少，不足以對疏水相互作用產生影響[20]。

圖4 不同環境中纖維素對兒茶素的吸附情況Fig.4 Adsorption of catechins by cellulose in different environments

2.2.2 pH對吸附的影響

由圖4可知，相比于其他2個環境因素，pH對兒茶素吸附量的影響最大。兒茶素的吸附量在pH從2.0上升到5.0時略有下降，但沒有顯著性差異；而當pH從5.0上升到7.0時，兒茶素的吸附量顯著上升，并在pH 7時呈現最大吸附，說明纖維素在中性環境下可以吸附更多的兒茶素。這可能是兒茶素在較低的pH條件下電離不完全，靜電相互作用對兒茶素吸附的貢獻相對較小；而在較高pH時，兒茶素失去了質子，有更多的負位，從而使裸露的氧原子有更多的孤對電子從而更容易與纖維素表面發生相互作用[13]。LIU等[13]提出的鍵能理論同樣能解釋這一現象：在pH較小時，范德華力和氫鍵對結合的貢獻大于靜電相互作用，而pH對纖維素表面電位變化和兒茶素電離作用的影響又只能決定靜電相互作用的大小，所以兒茶素的吸附受pH影響不大。靜電相互作用對單寧和植物細胞壁材料之間的結合沒有貢獻[17,22]。但是，和本實驗結果不同的是，PHAN等[20]研究發現，對于未帶電荷的化合物(+/-)兒茶素，pH值對其被BC吸附沒有顯著影響。同樣的，BOURVELLEC等[23]報道，未帶電荷的原花青素與蘋果細胞壁形成復合物在pH為2.2～7.0內不受影響。

2.2.3 溫度對吸附的影響

由圖4可知，相比于其他2個環境因素，溫度對兒茶素吸附量的影響最小。溫度的增加會使兒茶素的吸附量有極少量的增加，但是3個溫度梯度之間沒有統計學意義上的顯著性。由此可以推測，實驗中的溫度變化對纖維素和酚類的物理化學性質影響不大。酚類在4～37 ℃內相對穩定，不會因為分子內能量增高而使氫鍵減弱，影響纖維素對其的吸附能力；其次，酚類在水中的溶解度也并不會在此溫度區間內有較大的改變[20]。可以預測，無論是在低溫、常溫，還是在高溫貯藏狀態下，酚類的吸附量始終維持在一個較為穩定的水平。PHAN等[20]與本實驗得到了相同的結論，但是LIU等[7]在用纖維素吸附兒茶素時，得到了吸附量隨溫度升高而降低的結論。

2.3 纖維素吸附酚類物質前后的化學結構變化

a-纖維素樣品XPS圖譜；b-纖維素樣品C1s特征峰；c-纖維素吸附兒茶素后的樣品XPS圖譜； d-纖維素吸附兒茶素后的樣品C1s特征峰圖5 纖維素吸附兒茶素前后的XPS圖譜和C1s特征峰Fig.5 XPS spectra and C1s characteristic peaks of cellulose before and after catechin adsorption

表2 吸附兒茶素前后纖維素表面O/C值以及C1s峰面積Table 2 The O/C ratio and C1s peak area of cellulose surface before and after catechin adsorption

2.4 纖維素/酚復合顆粒的抗氧化能力

以純白果殼納米纖維素為對照，用DPPH和ABTS兩個指標評價白果殼纖維素吸附兒茶素后形成的纖維素/酚復合顆粒的抗氧化能力。圖6表明，純纖維素顆粒的自由基清除能力約為0，即幾乎沒有抗氧化能力，纖維素/酚復合顆粒具有優異的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除活性，且清除能力隨著加入的懸浮液體積的增加而上升，兩者呈線性關系。當纖維素/酚復合顆粒懸浮液加入至2 mL時，DPPH自由基清除能力可達82%，ABTS陽離子自由基清除能力略小于DPPH，為65%。由此說明，酚類物質吸附到白果殼纖維素上后依然能發揮其天然抗氧化功能，大大增強復合顆粒的抗氧化能力，這為將復合顆粒作為乳液穩定劑錨定在油水界面以防止乳液內油脂氧化提供了可能。

圖6 吸附酚后的纖維素顆粒的自由基清除能力Fig.6 Free radical scavenging ability of cellulose particles after adsorbing phenol

3 結論與討論

本研究對白果殼納米纖維素的孔性能以及兒茶素、茶多酚、沒食子酸、阿魏酸和EGCG在其上的吸附特性進行了考察，探究了環境因素對多酚吸附量的影響和吸附前后纖維素表面化學結構的變化，測定了纖維素/酚復合顆粒的抗氧化能力。結果發現，纖維素具有良好的吸附行為，對酚類物質存在自發吸附過程，且吸附速率均呈先快后慢，最后達到平衡的特點。其中，纖維素對兒茶素吸附最多，為3.7 mg/g纖維素。中性pH和高離子強度有利于纖維素對酚的吸附，而溫度對吸附的影響不大。纖維素吸附多酚后，其表面化學性質發生改變。纖維素對酚的吸附使纖維素/酚復合顆粒的抗氧化能力隨含量的增加而增強，當加入的懸浮液體積為2 mL時，其DPPH自由基清除能力可達82%。這些發現進一步證明了白果殼納米纖維素可以作為多酚吸附劑吸附多種酚類物質，且形成的纖維素/酚納米顆粒能發揮良好的抗氧化活性。后續研究會嘗試利用該纖維素/酚復合顆粒穩定Pickering乳液，使其在油水界面發揮一定的抗氧化作用，減緩乳液內油脂的氧化，為開發具有良好界面抗氧化活性的Pickering乳液奠定基礎。