核桃種皮多酚的大孔樹脂法分離與液質聯用法鑒定

孫敬敬，楊瑞金，楊進潔，張文斌*

1(江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 3(煙臺雙塔食品股份有限公司，山東 招遠，265404)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬植物，世界四大堅果之一，有補腎、益智、固精強腰、溫肺定喘、潤腸通便等功效[1]。核桃仁作為一種高油料作物，含有角鯊烯、維生素及多酚等多種活性物質，經濟價值較高。核桃種皮約占核桃仁質量的5%～10%，核桃仁中90%以上的多酚類物質都集中于種皮中，主要為酚酸、水解鞣質及少量黃酮類成分[2]。核桃多酚具有多種生物活性，如抗氧化、清除自由基、預防心臟病、改善血液循環、抗動脈粥樣硬化、抗炎等[3-4]。然而，種皮中的多酚容易通過氫鍵、疏水相互作用及離子鍵等與蛋白結合，影響核桃蛋白的功能特性[5]。且因核桃種皮的苦味和澀味，在食品生產加工過程中常被當作廢物處理[6]。核桃乳加工中常用濕堿法去皮，導致企業每生產1 t核桃乳就會產生數噸的堿性廢水，在鮮食核桃仁及核桃蛋白粉等食品加工制作過程中也常做脫皮處理，造成了種皮多酚的極大浪費。

目前多酚的純化方法主要有硅膠柱層析法、葡聚糖凝膠色譜法和大孔吸附樹脂法等。大孔樹脂因操作簡單、可回收再生，具有良好的吸附選擇性和穩定性及不易受酸堿和雜質的影響等優點而被國內外學者廣泛應用于天然活性物質的分離純化[7]。GUO等[8]研究表明獼猴桃果皮多酚經NKA-II樹脂純化后純度由33.2%提高到了55.26%。張旭等[9]采用AB-8樹脂對核桃青皮汁多酚進行純化，使得多酚純度提高了4.68倍。徐佳[10]用HZ-801型樹脂對核桃外果皮多酚提取液進行純化，多酚含量由純化前的8.00%提高到了17.68%。國內外對核桃多酚的純化和抗氧化性等方面研究較多，然而，對核桃種皮多酚大孔吸附樹脂富集分離時，其功效組分的保留情況關注較少。

與此同時，國內外有少數關于核桃多酚的鑒定研究，趙聰[11]采用HPLC方法鑒定出核桃種皮多酚中含有表兒茶素、沒食子酸和槲皮素等8種酚類物質。LIU等[12]采用超高效液相色譜串聯質譜在核桃仁中鑒定出黃酮、單寧和酚酸等27種多酚類物質。REGUEIRO等[2]研究結果表明核桃仁中的主要的酚類物質是鞣花單寧、鞣花酸及其衍生物。ZHANG等[13]在核桃種皮中鑒定出鞣花酸、奎寧酸、香豆酸、對香豆酸、原兒茶酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸和丁香酸等32種酚類物質。現有的研究中大多是直接對核桃多酚類物質鑒定，卻鮮有關于核桃種皮多酚的純化及鑒定的綜合研究。

本文為提高核桃種皮多酚的純度，篩選適宜富集核桃種皮多酚的大孔樹脂，優化分離工藝條件，并采用液質聯用技術對純化后保留的多酚組分進行鑒定，為進一步開發利用核桃種皮多酚提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃仁，云南省臨滄市；沒食子酸、無水乙醇、福林酚、無水Na2CO3、濃鹽酸等均為分析純，國藥集團；AB-8、D101、NKA-9、HPD 100樹脂，天津市光復精細化工研究所。

LE2002E電子天平、DELTA-320型pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；M348834旋渦振蕩器，德國IKA公司；水浴恒溫振蕩器，常州諾基儀器有限公司；酶標儀，南京拜爾沃克公司；RV10型旋轉蒸發儀，廣州儀科實驗技術有限公司；冷凍干燥機，北京BMH有限公司；HD-3000紫外檢測儀，上海嘉鵬科技有限公司；玻璃層析柱，上海五相儀器儀表有限公司；超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多酚樣品的制備及標準曲線的繪制

參照文獻[14]制備核桃種皮多酚提取液，旋蒸后冷凍干燥，凍干的粗酚樣品貯存于4 ℃冰箱。

多酚含量的測定：精確稱取沒食子酸標準品，蒸餾水溶解定容配制成100 μg/mL的母液。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的標準溶液于比色管中，加水補足至1 mL，加入1 mL質量分數為10%的Na2CO3溶液和0.5 mL福林酚試劑(稀釋10倍)，混勻后，室溫避光反應1.5 h，測定765 nm處的吸光度，以標準溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。以同樣的方法將樣品溶液稀釋至一定濃度后，測定樣品的吸光值。

1.2.2 大孔樹脂的預處理

大孔樹脂用體積分數95%乙醇溶液浸泡12 h,蒸餾水洗至無醇味，再用質量分數4%NaOH溶液浸泡處理4 h，蒸餾水沖洗至中性；最后用質量分數4%鹽酸浸泡4 h，蒸餾水洗樹脂至中性，備用。

1.2.3 樹脂的選型

分別稱取1.00 g預處理的4種濕樹脂于100 mL錐形瓶中，加入2 mg/mL核桃種皮多酚溶液20 mL，密封置于25 ℃水浴搖床上，150 r/min持續振蕩12 h，使樹脂吸附飽和，從上清液中取樣測定多酚含量。將吸附飽和的樹脂真空抽濾，用蒸餾水潤洗至樹脂表面無酚液殘留，加入20 mL的體積分數為70%乙醇溶液解吸6 h，測定解吸液中多酚含量。依據公式(1)～公式(3)計算樹脂吸附量(mg/g)、吸附率(%)和解吸率(%)：

(1)

(2)

(3)

式中：ρ0，初始多酚質量濃度，mg/mL；ρ1，吸附后多酚液質量濃度，mg/mL；ρ2，解吸液多酚質量濃度，mg/mL；V1，吸附液體積，mL；V2，解吸液體積，mL；m，濕樹脂質量，g。

1.2.4 AB-8樹脂靜態吸附動力學曲線

處理方法同1.2.3，每隔0.5 h取0.5 mL上清液，按1.2.1測定吸光值，依據標準曲線計算上清液的多酚含量和吸附率，繪制飽和吸附曲線。

1.2.5 上樣液濃度對樹脂吸附率的影響

稱取1.00 g預處理好的AB-8樹脂各5份，依次加入20 mL質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的核桃種皮多酚溶液，密封置于25 ℃水浴搖床上，150 r/min持續振蕩3 h，測定上清液中的多酚含量，按公式(2)計算吸附率。

1.2.6 pH值對樹脂吸附率的影響

稱取1.00 g預處理好的AB-8樹脂各7份，依次加入20 mL pH值分別為1、2、3、4、5、6、7 的核桃種皮多酚溶液，密封置于25 ℃水浴搖床上，150 r/min持續振蕩3 h，測定上清液中的多酚含量，按公式(2)計算吸附率。

1.2.7 乙醇濃度對解吸率的影響

稱取1.00 g預處理好的AB-8樹脂各6份，依次加入20 mL pH 9.0，質量濃度為2 mg/mL的核桃種皮多酚溶液，密封置于25 ℃水浴搖床上，150 r/min持續振蕩吸附3 h后，抽濾后洗滌樹脂，分別加入體積分數為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液20 mL，瓶口密封，按1.2.3方法解吸并根據公式(3)計算解吸率。

1.2.8 大孔樹脂動態吸附及解吸

(1) 泄露曲線：將預處理好的AB-8樹脂20.00 g濕法裝入Φ1.0 cm×30 cm的層析柱(1 BV=35 mL)，用去離子水平衡過夜，將質量濃度為2 mg/mL，pH 3.0的核桃種皮多酚粗提液以1 mL/min流速上柱，10 mL每管收集流出液并測定多酚濃度，直至流出液多酚濃度(Ct)達到上樣液的多酚濃度(Co)的10%時停止進樣，繪制泄露曲線。

(2) 洗脫曲線：將質量濃度為2 mg/mL、pH 3.0的核桃多酚溶液以1 mL/min的流速上樣14 BV，經3 BV去離子水除雜后，用體積分數為70%乙醇溶液洗脫至無紫外吸收，10 mL每管收集洗脫液，測定多酚濃度，繪制洗脫曲線。

將洗脫液用旋轉蒸發儀蒸發去除乙醇，凍干后測定多酚純度。多酚類物質的純度定義為混合物中多酚類物質質量與混合物總質量的比值，如公式(4)所示：

(4)

1.2.9 核桃種皮多酚組分鑒定

通過超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜(ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spetrometry，UPLC-TOF-MS/MS)對核桃種皮中酚類物質進行鑒定。

色譜條件：Waters Acquity BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A為純乙腈，B為0.1%甲酸(體積分數)，梯度洗脫：0～0.1 min，5% A；0.1～5 min，5%～20% A；5～8 min，20%～40% A；8～10 min，40%～80% A；10～15 min，100% A。流速0.3 mL/min，DAD檢測波長為200～600 nm，進樣量5 μL。

質譜條件：負離子模式，電噴霧離子化源，離子源溫度100 ℃，毛細管電壓3.0 kV，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑氣體流量500 L/h，掃描范圍m/z50～1 500。

1.2.10 數據分析

所有結果表示均為平均值±標準偏差，所有樣品均做3次平行實驗，分別用SPSS 22做統計學分析和Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 四種大孔樹脂對核桃種皮多酚的吸附和解吸性能比較分析

大孔樹脂的吸附是利用樹脂多孔網狀結構和高比表面積形成的分子篩作用，也與樹脂和目標物之間的范德華力或氫鍵締合能力有關[15]。如表1所示，AB-8樹脂的吸附量和解吸率顯著高于其他幾種樹脂。一般來說，極性化合物在極性樹脂上具有較好的吸附性能，雖然NKA-9樹脂為極性樹脂，但其吸附量和解吸率卻低于AB-8樹脂，可見樹脂的平均孔徑和比表面積等物理特性也能影響多酚類物質的吸附效果。綜合考慮，AB-8樹脂是最適合純化核桃種皮多酚的樹脂。

表1 大孔吸附樹脂的吸附及解吸性能比較Table 1 Comparison of adsorption and desorption properties of resins

2.2 大孔樹脂的靜態吸附動力學曲線

如圖1所示，吸附開始的1 h 內核桃種皮多酚快速吸附至樹脂內部，多酚的吸附率迅速上升至70%，繼續振蕩吸附2 h后樹脂達到吸附飽和狀態，吸附率

圖1 AB-8樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1 Adsorption kinetics curve of AB-8 resin

無明顯變化。故選擇3 h為最佳吸附時間。

2.3 上樣液質量濃度對吸附效果的影響

如圖2所示，核桃種皮多酚上樣液質量濃度為2 mg/mL時，樹脂的吸附率最大，可能是核桃種皮多酚上樣液在低濃度時，樹脂仍有吸附位點剩余，多酚可以迅速擴散至樹脂內部；當上樣液質量濃度>2 mg/mL時，AB-8樹脂的吸附率隨濃度升高呈下降趨勢，可能是高濃度的上樣液會使樹脂內多酚類物質的擴散受到抑制，且上樣液濃度越高，雜質越多，會阻塞多酚分子進入樹脂，增大傳質阻力，從而引起樹脂吸附率下降。因此，核桃種皮多酚上樣液質量濃度選擇2 mg/mL為宜。

圖2 上樣液質量濃度對樹脂吸附率的影響Fig.2 Effect of walnut pellicle polyphenols concentration on adsorption rate

2.4 pH值對吸附效果的影響

如圖3所示，樹脂的吸附率隨核桃種皮多酚上樣液pH值的升高呈先上升后下降趨勢，pH>3.0時，樹脂的吸附率降低,表明酸性條件下能保持多酚的酚羥基結構，更有利于AB-8樹脂對核桃種皮多酚的吸附。因此，核桃種皮多酚上樣液最佳pH值為3.0。

圖3 pH值對樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of pH value on the adsorption rate

2.5 乙醇濃度對解吸率的影響

多酚類物質一般具有一定的極性和親水性，一般使用甲醇、乙醇及丙酮等作為樹脂的解吸溶劑，實際加工利用中乙醇的安全性較高且成本低，因而選擇乙醇溶液作為AB-8樹脂的解吸液。如圖4所示，AB-8樹脂的解吸率隨乙醇濃度的升高呈先上升后下降趨勢，當乙醇溶液體積分數為70%時，核桃種皮多酚的解吸率最大。當乙醇體積分數>70%時，樹脂解吸率

圖4 乙醇濃度對樹脂解吸率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate

下降，可能是因為高濃度乙醇溶液的極性與多酚的極性相差較大，核桃種皮多酚在乙醇溶液中的溶解度變低。在工業生產中，乙醇濃度過高容易使其揮發加快，在實際生產中也很難控制，因此選擇70%的乙醇溶液作為最適解吸溶液。

2.6 AB-8樹脂動態吸附泄露曲線及洗脫曲線

樹脂對目標物的吸附能力有限，當樹脂吸附的目標物濃度到達一定量時，樹脂對目標物的吸附作用會降低，進樣液便從樹脂柱上泄露。如圖5所示，以pH值為3.0，質量濃度為2 mg/mL的核桃種皮多酚溶液進行動態吸附，上樣14 BV時，流出液的多酚濃度可達到上樣液濃度的10%，繼續增加上樣體積，流出液的多酚濃度快速升高，樹脂的吸附能力降低，因此核桃種皮多酚的最大上樣量為14 BV；如圖6所示，用70%的乙醇溶液洗脫時，在1.5 BV時洗脫液多酚濃度達到最大，繼續洗脫至流出液在280 nm下無紫外吸收，此時洗脫液用量為4 BV。綜上可知，AB-8樹脂在動態吸附條件下，最大上樣量為14 BV，洗脫液用量為4 BV。

圖5 核桃種皮多酚在AB-8樹脂上的泄露曲線Fig.5 Breakthrough curves of walnut pellicle polyphenols on AB-8 resins

圖6 核桃種皮多酚在AB-8樹脂上的洗脫曲線Fig.6 Desorption curves of walnut pellicle polyphenols on AB-8 resins

2.7 核桃種皮多酚的組分鑒定

UPLC-TOF-MS/MS的分析表明，二級質譜比一級質譜專屬性更強，對物質的鑒定更準確，在含有甲酸的流動相中，有利于核桃種皮中多酚類物質的鑒定。對核桃種皮多酚組分的鑒定結果如表2所示，主要是鞣花酸及其衍生物，其中包括含有六羥基聯苯二甲酰基即鞣花酰基(hexahydroxydiphenoyl，HHDP)的鞣花單寧含量最豐富。

表2 核桃種皮多酚組分鑒定表

如圖7所示，峰1和峰2給出準分子離子m/z為481[M-H]-和碎片離子m/z300.99(M-H-180，葡萄糖丟失)，m/z300.99為鞣花酸的分子離子峰與文獻[16]報道一致，初步鑒定為鞣花酰基葡萄糖異構體。峰3和峰8給出準分子離子m/z為783，在m/z481(M-H-302，HHDP丟失)和m/z301(M-H-481，HHDP-葡萄糖丟失)處產生主要片段離子，這種碎裂方式可能是二鞣花酰基葡萄糖，已被報道為核桃中主要的鞣花單寧之一[17]。在一級質譜中，峰4、峰5、峰6等多個出峰位置均鑒定出m/z為951準分子離子，二級質譜中還檢測到m/z907、783(M-H-168，沒食子酸損失)、481(M-H-469，三沒食子酰基丟失)、301和275的碎片，該物質可能是三沒食子酰基鞣花酰基葡萄糖[2]。峰12給出準分子離子m/z為935和碎片離子m/z301和275，該物質可能為木麻黃素或木麻黃鞣亭異構體，與文獻[18]鑒定結果一致。在m/z為933處的物質被鑒定為Glansrin C異構體，在m/z631(M-H-301，HHDP丟失)、m/z481(M-452，三沒食子酰基團丟失)、m/z451(M-482，HHDP-葡萄糖丟失)和m/z301處可鑒定出主要的MS2片段。

圖7 核桃種皮多酚負離子模式總離子流圖Fig.7 Total ion current diagram of walnut pellicle polyphenol in negative ion mode

峰24可能為鞣花酸，因鞣花酸在負離子模式掃描時失去1個H，產生m/z300.99分子離子峰，在m/z257(M-44，CO2丟失)、229(M-44-28，CO2和CO丟失)和185(丟失2個CO2和1個CO)處產生碎片離子，與文獻[19]報道一致。此外，m/z分別為463和433的物質分別可能為鞣花酸己糖異構體和鞣花酸戊糖異構體，二者均在m/z300.99處產生離子碎片[13]。

在MS2質譜的基礎上，[M-H]-在m/z592處，MS2片段在403、343、241和197處的化合物可能為Glansreginins A，與文獻[19-20]報道一致。峰20給出準分子離子m/z為785，在m/z301和275處產生主要碎片離子，這種碎裂模式可能是二沒食子酰基-鞣花酰基-葡萄糖[19]。峰25給出準分子離子m/z為787，在m/z617、169和125處產生主要碎片離子，這種碎裂模式可能是四沒食子酰基葡萄糖[19]。此外，大量文獻報道核桃中還含有綠原酸、丁香酸、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素和兒茶素等多種單體酚酸及其衍生物，可能是由于核桃原料的來源和基因存在差異，致使本文鑒定出的核桃種皮多酚種類與相關文獻報道存在差異[21]。

3 結論

試驗篩選出AB-8樹脂是最適合富集核桃種皮多酚的樹脂，靜態吸附的最佳工藝為：上樣液質量濃度2 mg/mL，pH 3.0，吸附時間3 h，解吸液為體積分數70%的乙醇溶液，動態吸附最大上樣量為14 BV，洗脫液用量為4 BV，此工藝可使核桃種皮多酚純度提高至純化前的2.91倍。UPLC-TOF-MS/MS鑒定出核桃種皮多酚組分主要為鞣花酸、鞣花酰基葡萄糖異構體、二鞣花酰基葡萄糖、三沒食子酰基鞣花酰基葡萄糖、四沒食子酰基葡萄糖、木麻黃素/木麻黃鞣亭異構體、Glansrin C 異構體、鞣花酸己糖異構體、鞣花酸戊糖異構體及Glansreginin A等30種多酚組分。本文對酸性乙醇超聲提取的核桃內種皮多酚進行了大孔吸附樹脂富集探索，篩選出能保留鞣花酸及其衍生物等主要功效成分的初步分離方法，可為核桃種皮多酚的開發提供新的指引。