2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑高效液相色譜分析

李 婷，聶 果，許艷秋，陳丙坤，王廣成，高立明

（四川省農(nóng)藥檢定所，成都 610041）

丁子香酚（Eugenol）又名丁香酚，CAS登錄號(hào)為97-53-0，EINECS（歐洲現(xiàn)有商業(yè)化學(xué)品目錄）登錄號(hào)為202-589-1，分子式C10H12O2，化學(xué)名稱為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚。因具備有抑菌、殺病毒的作用，其常作為醫(yī)用藥物，在農(nóng)用方面作為植物源殺菌劑，對(duì)黃瓜枯萎病、蘋果斑點(diǎn)落葉病等有較好防效，且與苦參堿合理混配后對(duì)葡萄灰霉病菌增效明顯[1-3]。

香芹酚（Carvacrol）又名異百里香酚，CAS登錄號(hào)為499-75-2，EINECS登錄號(hào)為207-889-6，分子式C10H14O，化學(xué)名稱為2-甲基-5-異丙基苯酚。香芹酚常用于消毒劑、殺菌劑、香料及化妝品的配方中。香芹酚作為植物源殺蟲劑，對(duì)玉米害螨具有較好的防效；作為植物源殺菌劑，對(duì)辣椒白粉病、葡萄霜霉病具有較好防效，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)辣椒和葡萄生長，對(duì)楊梅致病菌也具有非常好的抑菌效果[4-7]。

目前，國內(nèi)已有8個(gè)丁子香酚單劑、7個(gè)香芹酚單劑、1個(gè)兩者混配農(nóng)藥登記，均是前景較好的植物源農(nóng)藥。國內(nèi)外在飼料和中藥材的香芹酚和丁子香酚的液相色譜分析方法已有相關(guān)報(bào)道[8-9]，使用高效液相色譜同時(shí)檢測香芹酚和丁子香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法未見報(bào)道，因此本研究采用反相高效液相色譜法對(duì)丁子香酚·香芹酚可溶液劑進(jìn)行定量分析。該方法操作簡便、快速，準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到定量分析的要求，可以為企業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱，安捷倫科技有限公司。丁子香酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）、香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%），山東西亞化學(xué)股份有限公司；2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑，成都新朝陽作物科學(xué)股份有限公司；甲醇（色譜純），四川西隴科學(xué)有限公司；磷酸（分析純）、乙腈（色譜純），成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 色譜條件

Agilent 1260 二極管陣列檢測器；色譜柱：ZORBAX SB-C18［250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm］不銹鋼柱；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）；流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長275 nm；進(jìn)樣體積：5.0 μL；保留時(shí)間：丁子香酚約為5.2 min；香芹酚約為8.2 min。

上述典型操作條件，可根據(jù)不同儀器特點(diǎn)，對(duì)給定的操作條件作適當(dāng)調(diào)整，以期獲得最佳效果。典型的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標(biāo)樣液相色譜圖

圖2 試樣液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱取丁子香酚標(biāo)準(zhǔn)品0.15 g、香芹酚0.05 g（精確至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容；分別準(zhǔn)確移取上述兩者溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱取2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品2 g（精確至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容，超聲波溶解提取10 min，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，收集濾液備用。

1.3.3 線性溶液的配制

分別稱取丁子香酚標(biāo)樣0.167 2 g、香芹酚標(biāo)樣0.059 3 g于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成丁子香酚濃度為3.310 6 mg/mL、香芹酚濃度為1.174 1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)母液。分別準(zhǔn)確移取丁子香酚和香芹酚標(biāo)準(zhǔn)母液2.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

1.3.4 測定

在1.2色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，當(dāng)相鄰2針的峰面積變化小于1.5%時(shí)，按照標(biāo)準(zhǔn)溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序進(jìn)樣進(jìn)行分析測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液中丁子香酚和香芹酚的峰面積，按式（1）計(jì)算試樣中丁子香酚和香芹酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w。

式中：A1、A2分別為標(biāo)樣和試樣溶液中丁子香酚（香芹酚）峰面積的平均值，mAU·min；m1為丁子香酚（香芹酚）標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；ws為標(biāo)樣中丁子香酚（香芹酚）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；5為丁子香酚（香芹酚）標(biāo)樣稀釋倍數(shù)。

方法回收率P，%按照式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：m實(shí)測為加標(biāo)樣品有效成分質(zhì)量的實(shí)測值，mg；m樣品為試樣中有效成分的理論質(zhì)量，mg；m添加為試樣中添加有效成分的質(zhì)量，mg。

根據(jù)CIPAC方法驗(yàn)證指南[10]，評(píng)價(jià)該分析方法的精密度，即當(dāng)精密度試驗(yàn)中的RSD＜RSDr時(shí)，精確性結(jié)果才是可接受的，按式（3）計(jì)算RSDr：

式中：RSDr為室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；C為測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器的光譜數(shù)據(jù)采集功能，對(duì)丁子香酚、香芹酚標(biāo)樣在190～400 nm波長下進(jìn)行掃瞄。丁子香酚的最大吸收波長為220 nm，次大吸收波長為280 nm；香芹酚的主要吸收波長為220、275 nm。丁子香酚與香芹酚紫外曲線交叉點(diǎn)吸收波長為230、280 nm。因在低紫外補(bǔ)充下易產(chǎn)生雜質(zhì)干擾，且香芹酚的含量較低，選擇香芹酚的較大吸收波長275 nm作為方法的檢測波長。經(jīng)檢測驗(yàn)證，在此波長下，2種物質(zhì)均有較好的吸收，且無干擾雜質(zhì)峰，基線平穩(wěn)，峰高適中，故275 nm波長適用于本分析方法。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)試樣進(jìn)行分離檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，出峰不對(duì)稱，峰形拖尾；改用磷酸溶液為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱；乙腈-0.1%磷酸水溶液，分離效果比較好，但乙腈成本較高、毒性較大，故選擇甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）作為流動(dòng)相。其試樣分離情況較佳，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中，是較好的分離條件。

2.3 方法的線性相關(guān)性分析

用1.3.3配制5個(gè)不同濃度的丁子香酚、香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，丁子香酚濃度為0.264 9～1.324 2 mg/mL，香芹酚濃度為0.093 9～0.469 6 mg/mL，在1.2所述色譜操作條件下對(duì)系列溶液進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到丁子香酚的線性方程為y=4 019.6x＋12.548，R2=0.999 6；香芹酚的線性方程為y=3 880.6x-2.217 9，R2=0.999 7。丁子香酚和香芹酚的R2均大于0.999，則說明該方法線性關(guān)系良好。

2.4 方法精密度

取同一丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品，按照1.2所述分析條件進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果見表1。丁子香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為1.514%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004 9%，RSD為0.32%；香芹酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.531%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004 0%，RSD為0.75%。丁子香酚、香芹酚的RSD均遠(yuǎn)小于對(duì)應(yīng)的RSDr，符合CIPAC方法驗(yàn)證指南要求，說明該方法精密度高。

表1 精密度測定結(jié)果

2.5 方法準(zhǔn)確度

分別稱取已測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品，每個(gè)樣品中都加入一定量的丁子香酚和香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2所述的色譜條件測定樣品中丁子香酚和香芹酚的總質(zhì)量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。丁子香酚回收率范圍為：98.73%～100.18%，平均值為99.52%；香芹酚回收率范圍為：99.32%～100.64%，平均值為99.97%。丁子香酚、香芹酚的回收率在98.73%～100.64%，CIPAC方法驗(yàn)證指南中要求為97%～103%，滿足定量分析對(duì)回收率的要求。

表2 丁子香酚和香芹酚添加回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法對(duì)測定2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑的有效成分含量具有簡便、快速及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，線性關(guān)系良好，可用于復(fù)配制劑中丁子香酚、香芹酚有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)量控制和檢測。