2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑高效液相色譜分析

李 婷，聶 果，許艷秋，陳丙坤，王廣成，高立明

（四川省農藥檢定所，成都 610041）

丁子香酚（Eugenol）又名丁香酚，CAS登錄號為97-53-0，EINECS（歐洲現有商業化學品目錄）登錄號為202-589-1，分子式C10H12O2，化學名稱為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚。因具備有抑菌、殺病毒的作用，其常作為醫用藥物，在農用方面作為植物源殺菌劑，對黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病等有較好防效，且與苦參堿合理混配后對葡萄灰霉病菌增效明顯[1-3]。

香芹酚（Carvacrol）又名異百里香酚，CAS登錄號為499-75-2，EINECS登錄號為207-889-6，分子式C10H14O，化學名稱為2-甲基-5-異丙基苯酚。香芹酚常用于消毒劑、殺菌劑、香料及化妝品的配方中。香芹酚作為植物源殺蟲劑，對玉米害螨具有較好的防效；作為植物源殺菌劑，對辣椒白粉病、葡萄霜霉病具有較好防效，同時能夠調節辣椒和葡萄生長，對楊梅致病菌也具有非常好的抑菌效果[4-7]。

目前，國內已有8個丁子香酚單劑、7個香芹酚單劑、1個兩者混配農藥登記，均是前景較好的植物源農藥。國內外在飼料和中藥材的香芹酚和丁子香酚的液相色譜分析方法已有相關報道[8-9]，使用高效液相色譜同時檢測香芹酚和丁子香酚的質量分數的方法未見報道，因此本研究采用反相高效液相色譜法對丁子香酚·香芹酚可溶液劑進行定量分析。該方法操作簡便、快速，準確度和精密度均能達到定量分析的要求，可以為企業生產過程質量控制和質檢機構檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱，安捷倫科技有限公司。丁子香酚標準品（純度≥99.0%）、香芹酚標準品（純度≥99.0%），山東西亞化學股份有限公司；2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑，成都新朝陽作物科學股份有限公司；甲醇（色譜純），四川西隴科學有限公司；磷酸（分析純）、乙腈（色譜純），成都市科隆化學品有限公司。

1.2 色譜條件

Agilent 1260 二極管陣列檢測器；色譜柱：ZORBAX SB-C18［250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm］不銹鋼柱；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）；流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長275 nm；進樣體積：5.0 μL；保留時間：丁子香酚約為5.2 min；香芹酚約為8.2 min。

上述典型操作條件，可根據不同儀器特點，對給定的操作條件作適當調整，以期獲得最佳效果。典型的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標樣液相色譜圖

圖2 試樣液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 標樣溶液的配制

準確稱取丁子香酚標準品0.15 g、香芹酚0.05 g（精確至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容；分別準確移取上述兩者溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

準確稱取2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品2 g（精確至0.000 2 g），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容，超聲波溶解提取10 min，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，收集濾液備用。

1.3.3 線性溶液的配制

分別稱取丁子香酚標樣0.167 2 g、香芹酚標樣0.059 3 g于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成丁子香酚濃度為3.310 6 mg/mL、香芹酚濃度為1.174 1 mg/mL的混合標準母液。分別準確移取丁子香酚和香芹酚標準母液2.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

1.3.4 測定

在1.2色譜操作條件下，待儀器基線穩定后，連續數針標準溶液進樣，當相鄰2針的峰面積變化小于1.5%時，按照標準溶液、試樣溶液、試樣溶液、標準溶液的順序進樣進行分析測定。

1.4 數據分析

根據標準品和樣品溶液中丁子香酚和香芹酚的峰面積，按式（1）計算試樣中丁子香酚和香芹酚的質量分數w。

式中：A1、A2分別為標樣和試樣溶液中丁子香酚（香芹酚）峰面積的平均值，mAU·min；m1為丁子香酚（香芹酚）標樣的質量，g；m2為試樣的質量，g；ws為標樣中丁子香酚（香芹酚）的質量分數，%；5為丁子香酚（香芹酚）標樣稀釋倍數。

方法回收率P，%按照式（2）進行計算。

式中：m實測為加標樣品有效成分質量的實測值，mg；m樣品為試樣中有效成分的理論質量，mg；m添加為試樣中添加有效成分的質量，mg。

根據CIPAC方法驗證指南[10]，評價該分析方法的精密度，即當精密度試驗中的RSD＜RSDr時，精確性結果才是可接受的，按式（3）計算RSDr：

式中：RSDr為室內相對標準偏差，%；C為測定質量分數，%。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器的光譜數據采集功能，對丁子香酚、香芹酚標樣在190～400 nm波長下進行掃瞄。丁子香酚的最大吸收波長為220 nm，次大吸收波長為280 nm；香芹酚的主要吸收波長為220、275 nm。丁子香酚與香芹酚紫外曲線交叉點吸收波長為230、280 nm。因在低紫外補充下易產生雜質干擾，且香芹酚的含量較低，選擇香芹酚的較大吸收波長275 nm作為方法的檢測波長。經檢測驗證，在此波長下，2種物質均有較好的吸收，且無干擾雜質峰，基線平穩，峰高適中，故275 nm波長適用于本分析方法。

2.2 流動相的選擇

分別用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，對試樣進行分離檢測。試驗結果表明，采用甲醇-水為流動相時，出峰不對稱，峰形拖尾；改用磷酸溶液為流動相，峰形對稱；乙腈-0.1%磷酸水溶液，分離效果比較好，但乙腈成本較高、毒性較大，故選擇甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）作為流動相。其試樣分離情況較佳，峰形對稱，保留時間適中，是較好的分離條件。

2.3 方法的線性相關性分析

用1.3.3配制5個不同濃度的丁子香酚、香芹酚標準品溶液，丁子香酚濃度為0.264 9～1.324 2 mg/mL，香芹酚濃度為0.093 9～0.469 6 mg/mL，在1.2所述色譜操作條件下對系列溶液進行分析。以標準品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到丁子香酚的線性方程為y=4 019.6x＋12.548，R2=0.999 6；香芹酚的線性方程為y=3 880.6x-2.217 9，R2=0.999 7。丁子香酚和香芹酚的R2均大于0.999，則說明該方法線性關系良好。

2.4 方法精密度

取同一丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品，按照1.2所述分析條件進行6次平行測定，結果見表1。丁子香酚質量分數平均值為1.514%，標準偏差為0.004 9%，RSD為0.32%；香芹酚質量分數平均值為0.531%，標準偏差為0.004 0%，RSD為0.75%。丁子香酚、香芹酚的RSD均遠小于對應的RSDr，符合CIPAC方法驗證指南要求，說明該方法精密度高。

表1 精密度測定結果

2.5 方法準確度

分別稱取已測定質量分數的2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑樣品，每個樣品中都加入一定量的丁子香酚和香芹酚標準品，按照1.2所述的色譜條件測定樣品中丁子香酚和香芹酚的總質量，計算回收率，結果見表2。丁子香酚回收率范圍為：98.73%～100.18%，平均值為99.52%；香芹酚回收率范圍為：99.32%～100.64%，平均值為99.97%。丁子香酚、香芹酚的回收率在98.73%～100.64%，CIPAC方法驗證指南中要求為97%～103%，滿足定量分析對回收率的要求。

表2 丁子香酚和香芹酚添加回收率測定結果

3 結論

試驗結果表明，本方法對測定2%丁子香酚·香芹酚可溶液劑的有效成分含量具有簡便、快速及分離效果好的優點，方法重現性好，準確度高，線性關系良好，可用于復配制劑中丁子香酚、香芹酚有效成分質量分數的質量控制和檢測。