植物免疫誘導劑酰氨寡糖素對環境非靶標生物的毒性研究

周欣欣，吳聲敢，王 倬，焦思明，藍 帥，袁善奎*

（1.農業農村部農藥檢定所，北京 100125；2.浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，杭州 310021；3.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

綠色農業是現代農業發展的主要方向，這對解決糧食和食品安全問題具有重要的戰略意義。通過激活植物或動物的免疫系統來實現病蟲害的免疫防控，可以降低化學農藥的使用，建立起以環境友好、食品安全為導向的現代綠色農業生產體系。海洋是一個巨大的生物資源寶庫，開展海洋生物資源的高值化利用已成為各國發展海洋經濟的重大舉措。海洋生物普遍具有高蛋白、高碳水化合物和低脂的特點，是多糖、多肽的豐富來源[1]。海洋生物多糖是海藻多糖、海洋動物多糖和海洋微生物多糖的總稱。此類物質均含有多聚糖及酸性黏多糖，因其具有多種藥用功能，已成為當前的研究熱點[2]。其中，酰氨寡糖素（Hetero-chitooligosaccharide）是利用序列精控的生物酶解技術從海洋生物甲殼類原料中降解得到的特定結構幾丁類寡糖，脫乙酰度在50%～70%，具有更優的生物活性及物理化學性質，屬于一種新型免疫誘導劑。植物表面受體與其乙酰基團結合可以有效激活植物免疫系統[6-7]。例如，有研究發現[5-6]，該類誘導劑可通過誘導植物與抗蟲相關的基因（如幾丁質酶基因、蛋白酶抑制劑基因等）表達來提高植物的抗蟲能力，代謝產物中與抗蟲相關的物質（如單寧、總酚、糖類等）含量均有所增加，以及與抗性相關的酶活力升高等。同時，其對成蟲具有產卵驅避作用，可降低害蟲對作物的為害。

生物農藥多為低毒、微毒，對天敵安全，不傷害蜜蜂、鳥、魚等環境有益生物，且對環境污染較小。然而，生物農藥的種類繁雜，如S-烯蟲酯為一種昆蟲調節劑，屬于生物農藥，但對魚類、溞類等水生生物的毒性較高，具有致死效應[8]。酰氨寡糖素同為生物農藥，其市場應用價值巨大，為探索其對重要水生和陸生環境非靶標生物的毒性效應和安全風險，本研究選取了4種典型的環境非靶標生物（日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚和大型溞）為試驗對象，參照GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》[9-12]評估酰氨寡糖素對上述非靶標生物的環境毒性，旨在為該類產品的安全應用提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試生物。日本鵪鶉（Coturnix japonica），山東省日照市東港區老孟孵化場；意大利蜜蜂（Apis melliferaL.），浙江省義烏市佛堂鎮王煥興蜂廠；斑馬魚（Brachydanio rerio），AB型品系，中科院水生生物研究所；大型溞（Daphnia magna），沈陽化工研究院有限公司安全評價中心。

供試樣品。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC、7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL，中科榮信（蘇州）生物科技有限公司。

1.2 試驗條件

各環境非靶標生物毒性試驗條件如表1所示。

表1 不同非靶標生物的試驗條件

1.3 試驗方法

1.3.1 鳥類毒性試驗

根據GB/T 31270.9—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則第9部分：鳥類急性毒性試驗》[9]的要求，采用飼喂法開展限度試驗（或供試物所能配制的最大劑量），同時設置空膠囊對照組（原藥試驗）和空白對照組，各處理組均設1個重復，每組用10只日本鵪鶉（雌雄各5只）。在進行95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC試驗時，根據每只日本鵪鶉的體重稱量供試物，并裝入膠囊后進行灌喂；在進行7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL試驗時，將供試物按照1.0 mL/100 g體重，用移液槍經口給藥，經口灌喂后合并飼養。2 h后，調查中毒癥狀并按常規方法喂食。試驗期間，空白對照組的日本鵪鶉不進行任何處理。試驗設計見表2。試驗開始后，連續觀察并記錄日本鵪鶉在7 d內的中毒癥狀與死亡數。

表2 鳥類急性毒性試驗設計

1.3.2 蜜蜂毒性試驗

根據GB/T 31270.10—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[10]的要求，采用飼喂法開展經口限度試驗，同時設置50%蔗糖水（W/W）對照組。各處理組和對照組均設3個重復，每個重復10只蜜蜂。在飼喂器（一次性塑料滴管）中加入200 μL試驗溶液，對10只蜜蜂（1個重復）進行飼喂。暴露結束后，將飼喂器取出，并測定每個蜂籠中試驗溶液的消耗量，然后換用不含供試物的蔗糖水進行飼喂。試驗設計，見表3。給藥暴露處理后，觀察并記錄意大利蜜蜂在48 h內的中毒癥狀與死亡數。

表3 蜜蜂急性毒性試驗設計

1.3.3 魚類毒性試驗

根據GB/T 31270.12—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則第12部分：魚類急性毒性試驗》[11]的要求，采用半靜態法開展限度試驗。48 h后更換試驗溶液，同時設置空白對照處理，各處理組均設1個重復，每個重復為10尾斑馬魚。將供試物用曝氣自來水經超聲助溶30 min后定容，獲得試驗溶液（表4）。將配置的試驗溶液過0.45 μm濾膜后，取1.500 kg（約1.50 L，以水密度1.00 g/mL折算）倒入燒杯，用于試驗處理。試驗組和對照組同時進行，試驗期間停止喂食。

表4 魚類急性毒性試驗溶液配制表

1.3.4 溞類急性活動抑制試驗

根據GB/T 31270.13—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》[12]的要求，采用靜態法開展限度試驗，同時設置空白對照組，各處理組均設4個重復，并同時進行試驗。將供試物用適量試驗用水經超聲助溶30 min后定容，獲得試驗溶液（表5）。將配置的試驗溶液經0.45 μm濾膜過濾后，取50.0 mL加入到60 mm×3.8 mm（直徑×高）的結晶皿中，然后用滴管加入大型溞，每皿5只，蓋上皿蓋后，放入光照培養箱中進行培養。試驗開始后，定時觀察并記錄大型溞48 h內的受抑制數和中毒癥狀。試驗期間，對試驗體系不進行喂食。

表5 蟤類急性活動抑制試驗溶液配制表

1.4 數據處理

本試驗均為限度試驗。在進行數據處理時，根據試驗設置劑量（濃度）及其對應的非靶標生物死亡數來估算LD50、LC50和EC50值，并以此評估酰氨寡糖素對不同生物的急性毒性效應。

2 結果與分析

2.1 鳥類毒性試驗結果

試驗期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對照組的日本鵪鶉均未出現死亡，死亡率為0，且各處理組的日本鵪鶉均表現正常，表明在最大限度劑量下，其對日本鵪鶉無致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對日本鵪鶉的7 d-LD50值分別為＞2.24×103mg a.i./kg和＞762.6 mg a.i./kg。參考GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》中毒性等級劃分標準，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對日本鵪鶉低毒。

2.2 蜜蜂毒性試驗結果

試驗期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對照組的蜜蜂均未出現死亡，死亡率為0，且各處理組的蜜蜂均表現正常，表明在最大限度劑量下，其對意大利蜜蜂無致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對意大利蜜蜂的48 h-LD50值分別為＞130 μg a.i./蜂和＞118 μg a.i./蜂。參考GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》中毒性等級劃分標準，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對蜜蜂低毒。

2.3 魚類毒性試驗結果

試驗期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對照組的斑馬魚均未出現中毒癥狀，死亡率為0，表明在最大限度濃度下，其對斑馬魚無致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對斑馬魚的96 h-LC50值分別為＞168 mg a.i./L和＞150 mg a.i./L。參考GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》中毒性等級劃分標準，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對斑馬魚低毒。

2.4 蟤類活動抑制試驗結果

試驗期間，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL處理組、對照組的大型溞均未出現中毒癥狀，活動抑制率為0，表明在最大限度濃度下，其對大型溞無致死毒性。95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對大型溞的48 h-EC50值分別為＞224 mg a.i./L和＞152 mg a.i./L。參考GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》中毒性等級劃分標準，95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對大型溞低毒。

3 結論與討論

本研究選取了4種典型的環境非靶標生物，評估了95%酰氨寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對環境非靶標生物的急性毒性。研究發現，上述供試物在限度試驗條件下對日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚、大型溞均無致死毒性，表明此類產品對環境有益生物安全。

近年來，我國植物免疫誘導劑已有較大發展，蛋白激發子、寡糖、脫落酸、枯草桿菌及木霉作為一種新型的多功能生物農藥產品，在我國已經得到了廣泛應用。與傳統農藥不同，這些植物免疫誘導劑的共同特點是能誘導植物產生廣譜抗病蟲性，且不直接殺死病原菌[13]。研究表明，低脫乙酰度的幾丁類寡糖對植物的誘導活性比傳統殼寡糖產品更強，因此已成為最新的研究方向。根據中國農藥信息網數據匯總，已有106個氨基寡糖素（脫乙酰度＞70%）農藥產品取得正式登記并用于農業生產。然而，脫乙酰度在50%～70%的酰氨寡糖素中僅有7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL于2021年在甘藍小菜蛾上獲得登記。該產品對防治對象沒有直接毒性，通過誘導植物對有害生物的侵染產生防衛反應，以此提高植物的抗性。目前，國內外尚未建立該類生物農藥的環境安全性試驗準則，本研究僅參照化學農藥環境安全評價試驗方法開展了酰氨寡糖素醋酸鹽對4種典型環境生物的急性毒性試驗。此外，圍繞該類生物農藥的環境生物安全評價研究較少。根據《農藥登記環境風險評估指南》[14]程序，在初級風險評估較低（急性毒性試驗無危害）的情況下，不要求進行高級階段試驗（慢性毒性試驗）。本研究中，由于95%氨基寡糖素醋酸鹽TC和7.5%酰氨寡糖素醋酸鹽SL對4種典型非靶標生物日本鵪鶉、意大利蜜蜂、斑馬魚及大型溞均為低毒，故未開展慢性試驗。今后，我們還應結合該類化合物的特性，優化試驗方法，關注更多種類的非靶標生物并評估其慢性毒性，進一步研究和監測其對生態環境的影響。