氨肽酶P2在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義

蘇引利，李琳琳，莫佳婭，段浩然，張嘉琳，王秋杰，秦利影，吳 晗，謝 婭

(1.鄭州大學第一附屬醫院婦產科,河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學醫學科學院,河南 鄭州 450052)

卵巢癌是常見的女性惡性生殖系統腫瘤，其死亡率位于婦科惡性腫瘤之首[1]，全球年齡標準化的5 a凈生存率大多在30%～50%之間[2]。目前卵巢癌的主要治療方法為手術和化療，由于其早期臨床癥狀無特異性，80%的患者就診時已達中晚期，但即便是中晚期患者，有效的腫瘤減滅術仍可延長患者的生存時間[3-4]，而首次手術后癌殘存灶大小是影響預后的關鍵因素之一。因此，無論是早診斷還是手術完全切除原發癌灶和轉移灶對中晚期卵巢癌患者的治療都有著重要的作用。

氨基肽酶P2(XPNPEP2)編碼673個氨基酸的膜結合蛋白，定位于染色體Xq25-26.1上，是以Xaa-Pro作為識別位點廣泛存在于生物體的一種N-末端亞胺鍵的水解酶[5]。體內存在廣泛含有Xaa-Pro位點的活性肽為其底物，如激素、生長因子、神經遞質等[6]。但既往對于XPNPEP2的研究多集中于XPNPEP2參與緩激肽代謝[7]，與血管緊張素轉換酶抑制劑誘導的血管性水腫有關，繼而引發咳嗽[8]、低血壓[9]等癥狀。近年來，XPNPEP2在腫瘤中的調控作用受到重視。XPNPEP2在宮頸癌、胃癌、結直腸癌和乳腺癌組織中表達較正常組織上調，并且在結直腸癌和乳腺癌與疾病進展和患者的不良預后有關[10-14]。Cheng等[14]的研究表明，XPNPEP2通過誘導上皮-間充質轉變促進宮頸癌發展。最近，有文獻報道XPNPEP2是組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1,TMTP1)的靶蛋白之一[15]，TMTP1是一種新型腫瘤歸巢肽[16-17]，能識別并結合原位腫瘤和血管源性或轉移性腫瘤組織表面的特異性受體[18]，被用作抗腫瘤藥物的輸送載體，如聯合抗菌肽D2[19]、白喉毒素[20]、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體[21]以及順鉑和紫杉醇前體藥物[22]等。TMTP1不僅準確靶向腫瘤組織提高抗腫瘤療效，還能減輕脫靶導致的藥物毒性。但是，XPNPEP2/TMTP1能否作為用藥載體靶向識別卵巢癌原發灶和轉移灶尚無明確定論。

目前，上皮性卵巢癌作為一種高度侵襲性腫瘤，XPNPEP2在其中的表達情況尚未有詳細報道。本文中我們運用免疫組化和蛋白印跡的方法檢測XPNPEP2蛋白在正常卵巢組織、上皮性卵巢癌原發灶及與之配對的轉移癌灶和癌旁組織中的表達情況，并分析其與上皮性卵巢癌臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2021年9月于鄭州大學第一附屬醫院確診為上皮性卵巢癌并經過手術治療的患者40例，所取腫瘤原發灶標本均經病理確診為上皮性卵巢癌，其臨床分期采用國際婦產科聯盟(FIGO)制定的卵巢癌手術-病理分期(FIGO，2014年)標準。并同時取患者轉移至大網膜的轉移癌灶和癌旁組織35例。收集非癌患者經手術所取的正常卵巢組織標本15例作為對照。本次標本使用已經倫理委員會批準。本組病例收集情況見表1。

表1 XPNPEP2表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系 n(%)

1.2 主要試劑免疫組化一抗XPNPEP2(25945-1-AP)、二抗HRP標記的山羊抗兔(GB23303)、DAB顯色試劑盒(G1211)、蘇木素染色劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 蛋白印跡將綠豆粒大小組織放入1.5 mL離心管中，加適量組織裂解液(每mL RIPA裂解液內含100 mmol/L的苯甲基磺酰氟10 μL)并放入2～3顆研磨珠；震蕩研磨儀研磨；超聲裂解組織細胞；4 ℃、12 000 r/min離心15 min取上清；用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒配平各樣品蛋白濃度后，加入1/4體積蛋白上樣緩沖液；100 ℃金屬浴10 min變性；質量分數10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠80 V電泳90 min分離蛋白，300 mA電流2 h將蛋白全部轉移至聚偏氟乙烯膜；質量分數5%脫脂牛奶封閉2 h；兔抗人XPNPEP2多克隆抗體(11 000)一抗4 ℃孵育過夜；二抗(14 000)室溫孵育2 h；漂洗后ECL發光試劑盒顯色。使用Image J軟件測定蛋白相對表達量。以β-actin(14 000)作為蛋白表達的內參。

1.4 免疫組化將直徑1 cm左右的標本組織浸泡于組織固定液中，將組織經過脫水、滲透及石蠟包埋，將蠟塊以4 μm做連續切片，篩選出完整的樣本切片首先做HE染色，以確定所取組織為目標組織。然后將與之對應的樣本切片進行免疫組化染色。首先將切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟；再經過二甲苯、梯度酒精脫蠟脫水；組織切片依次進行抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、XPNPEP2一抗孵育過夜、HRP標記二抗孵育50 min、DAB顯色、蘇木精復染細胞核、自來水分化、最后脫水及中性樹脂封片。切片于正置顯微鏡觀察、圖像采集分析。

1.5 結果判斷免疫組化結果由2名有經驗的實驗員進行雙盲法閱片，并進行評分。切片中符合病理類型的細胞中出現棕色或褐色為XPNPEP2結果陽性細胞，按照組織染色強度和陽性細胞面積進行綜合評分。先將染色深淺與背景著色對比，再進行染色強度打分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細胞所占的百分比打分：陰性為0分，陽性細胞≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。評分標準為兩項評分相乘，得分為0～3分評估為XPNPEP2低表達，4～12分評估為XPNPEP2高表達。

1.6 數據庫使用基因表達譜動態分析數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)繪制分析XPNPEP2高表達與低表達患者的疾病無進展生存期和總生存期的關系[23]。

2 結果

2.1 XPNPEP2在不同卵巢組織中的表達XPNPEP2主要定位在上皮性卵巢癌原發灶與轉移癌灶腫瘤細胞的細胞膜和細胞質中，表現為細胞內出現棕褐色顆粒。XPNPEP2蛋白在上皮性卵巢癌原發灶和轉移癌灶呈高表達(4～12分)。而在正常卵巢組織及癌旁組織呈低表達(0～3分)，表現為正常細胞質內及細胞膜無染色或部分細胞略呈淡黃色。

2.1.1 XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發灶中的表達 免疫組化染色結果顯示，XPNPEP2在正常卵巢組織中多為低表達，高表達率13.33%(2/15)，而在上皮性卵巢癌原發灶中多為高表達，高表達率為82.50%(33/40)(χ2=22.553，P<0.001)。蛋白印跡結果顯示，上皮性卵巢癌原發灶中XPNPEP2蛋白相對表達量為0.893±0.214，明顯高于正常卵巢組織的0.269±0.155(t=4.843,P= 0.001)。見圖1、2。

圖1 免疫組化染色檢測XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發灶組織中的表達

圖2 蛋白印跡檢測XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發灶組織中的表達

2.1.2 XPNPEP2在癌旁和轉移癌灶組織中的表達 免疫組化染色結果顯示，XPNPEP2在癌旁組織中多為低表達，高表達率為14.29%(5/35)，而在轉移癌灶組織中多為高表達，高表達率為91.43%(32/35)(χ2=41.794，P<0.001)。蛋白印跡結果顯示，轉移癌灶組織中XPNPEP2蛋白的相對表達量為1.032±0.202，明顯高于癌旁組織的0.276±0.176(t=6.237，P<0.001)。見圖3、4。

圖3 免疫組化染色檢測XPNPEP2在癌旁組織和轉移癌灶組織中的表達

2.1.3 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發灶和轉移癌灶組織中的表達 免疫組化染色結果顯示，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發灶[82.50%(33/40)]和轉移癌灶[91.43%(32/35)]中均多為高表達，比較差異無統計學意義(χ2=0.631，P=0.427)。蛋白印跡結果顯示，上皮性卵巢癌原發灶與轉移癌灶中XPNPEP2蛋白的表達比較差異無統計學意義(t=0.624，P=0.549)。見圖5、6。

圖4 蛋白印跡檢測XPNPEP2在癌旁組織和轉移癌灶組織中的表達

圖5 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發灶和轉移癌灶組織中的表達

2.2 卵巢癌患者XPNPEP2蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系上皮性卵巢癌患者XPNPEP2表達水平與患者年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、腹水以及FIGO分期均無相關性(χ2=0.519，P=0.471；P=0.204；χ2=0.275，P=0.600；χ2=0.132，P=0.716；χ2=0.519，P=0.471；χ2=3.680，P=0.055)。見表2。

2.3 XPNPEP2蛋白表達與卵巢癌患者預后的關系為了解XPNPEP2在卵巢癌中高表達是否與患者的預后有關系，我們從GEPIA在線分析數據庫提取398例卵巢癌患者信息發現，XPNPEP2高表達組與低表達組的疾病無進展生存、總生存比較差異均無統計學意義(P=0.900、0.099)。見圖7。

圖6 蛋白印跡檢測XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發灶和轉移癌灶組織中的表達

圖7 不同XPNPEP2表達卵巢癌患者疾病無進展生存曲線(左)與總生存曲線(右)比較

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型，常見于50歲以上患者。目前，上皮性卵巢癌治療重難點在于早診斷、早治療，亟需發現新的治療方法、改善藥物輸送等來提高患者的生存率并改善其預后[24]。

XPNPEP2主要在腎臟、前列腺、結腸、肝臟及胰腺組織中表達，在卵巢組織中幾乎不表達。也有證據表明其在宮頸癌、胃癌、前列腺癌、結直腸癌和乳腺癌中表達高于正常組織，但在卵巢癌中表達情況尚不明確。羅丹楓[15]等通過檢測5例卵巢癌原發灶、正常卵巢組織和2例遠處轉移癌灶標本中XPNPEP2的RNA發現，XPNPEP2在原發灶中的表達要遠高于正常組織，且在2例轉移灶中XPNPEP2的表達和正常組織差別不顯著，但由于標本量過少限制其可靠性。本研究通過收集40例上皮性卵巢癌原發灶和配對的35例轉移灶、癌旁組織及15例正常卵巢組織發現，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發灶中的表達顯著高于正常卵巢組織，在轉移灶中的表達顯著高于癌旁組織，而在上皮性卵巢癌原發灶與轉移癌灶中表達無明顯差異。

為進一步探討XPNPEP2高表達在卵巢癌發生、發展中的作用，我們分析XPNPEP2與上皮性卵巢癌患者的臨床病理特征相關性發現，XPNPEP2在卵巢癌組織中的表達高低與患者年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、有無腹水以及FIGO分期均無關。通過GEPIA數據庫對398例卵巢癌患者進行生存分析發現，盡管卵巢癌患者XPNPEP2低表達組與高表達組的生存率無統計學差異，但XPNPEP2低表達組5 a生存曲線始終在高表達組之上，提示其可能與不良預后相關。本研究所收集標本主要為Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌數據較少，后續需擴大樣本量分析XPNPEP2對卵巢癌患者預后的影響。

2009年XPNPEP2被證實為腫瘤歸巢肽TMTP1的受體[15]。Yang等[16]經過體外體內實驗發現TMTP1可特異性結合到一系列中高度轉移潛能腫瘤細胞，但不與低度轉移潛能或非轉移性細胞結合。靜脈注射結合熒光素的TMTP1經24 h即可強烈并特異性靶向小鼠的轉移灶，甚至是隱匿性轉移灶。與之一致，雖然XPNPEP2在前列腺癌組織中的表達低于正常前列腺組織，但在有局部侵襲和淋巴結轉移的前列腺癌組織中表達高于局限性前列腺癌組織[25]。但我們的結果顯示XPNPEP2在卵巢癌原發灶和與轉移癌灶中表達無明顯差異，提示XPNPEP2在不同類型腫瘤原發癌灶的表達有差異。因此，TMTP1、XPNPEP2不僅可以作為臨床工作中區分原發性惡性腫瘤和轉移性腫瘤的標志物，也可利用熒光顯影術標記XPNPEP2實時準確定位轉移灶進行手術切除。此外，作為廣泛用于抗腫瘤藥物的輸送載體，TMTP1可能通過特異性識別轉移性腫瘤組織表面的XPNPEP2受體，用于準確定位腫瘤轉移灶進行腫瘤的靶向治療。本研究發現XPNPEP2在上皮性卵巢癌及其轉移癌灶中均高表達，為后期開發XPNPEP2、TMTP1示蹤劑進行手術準確定位上皮性卵巢癌原發灶及轉移灶、優化藥物載體進行腫瘤精準治療提供理論依據。