鈦種植體愈合期牙齦炎性浸潤及巨噬細胞極化的研究

張照欣 王新革 葛澤陽 黃石頭 李德華

種植體周圍炎(peri-implantitis, PI)是一種以結締組織炎癥及進行性邊緣骨吸收為病理特征的種植體生物學并發癥，其具體發病機制目前尚存在爭議[1-2]。Donath等[3]曾指出種植體與機體并非惰性結合的關系而是產生一定程度的異物反應。Albrektsson等[4]也認為狀態穩定的種植體其實是一種異物反應平衡的表現，其周圍長期保持炎性反應并產生免疫調節活動，巨噬細胞則是免疫調節活動的核心，全身及局部因素的刺激可導致免疫調節失衡而產生邊緣骨吸收。

有研究分析了骨結合過程中的免疫細胞參與特征，結果表明與窩洞自我愈合過程相比，鈦種植體可增強骨骼組織巨噬細胞等免疫細胞的活動[5]。而種植體周圍軟組織愈合過程中機體與材料之間的生物學事件以及免疫細胞的參與情況目前尚不明確。齦溝內以及種植體基臺界面微生物的存在也為免疫細胞的研究帶來干擾[6-7]。本實驗通過植入埋入式種植體，觀察在無細菌干擾的情況下鈦種植體表面牙齦愈合過程中免疫細胞的參與情況，為探討種植體周圍軟組織內的免疫環境提供依據。

1 材料與方法

1.1 基本材料

1.1.1 實驗動物 20 只SPF級雄性SD大鼠(第四軍醫大學動物中心提供)， 7 周齡，體質量150～170 g。

1.1.2 主要試驗儀器與試劑 口腔種植機(西諾普公司，瑞士)；牙科低速手機(NSK，日本)；定制鈦螺釘樣種植體(直徑1.6 mm，長度2.3 mm，西安中邦公司)；戊巴比妥鈉(西安第四軍醫大學口腔動物實驗中心)；實時定量 PCR 試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒 (Takara，日本)；CD206小鼠來源單克隆抗體(1/300)、Nos2小鼠源性單克隆抗體(1/300)、 CD68兔源性單克隆抗體(1/200， Santa，美國)；水浴生物組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將20 只SD大鼠隨機分為4 組，每組5 只。種植體植入后1、 4、 6 周各一組，每只大鼠左側上頜第一磨牙區域作為實驗側，右側建立同體對照，另有5 只不作處理作為空白對照。

1.2.2 拔除上頜第一磨牙 SD大鼠稱重后按45 mg/kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉行全身麻醉。仰臥位固定大鼠，常規鋪巾，探針分離牙齦后蚊式止血鉗夾持第一磨牙頰舌面牙頸部輕微搖晃，待牙齒松動后頰側脫位，拔除雙側第一磨牙。

1.2.3 種植體植入 愈合4 周后， 3%戊巴比妥鈉行大鼠全身麻醉。于左側牙槽嵴頂切開翻瓣暴露骨面，生理鹽水冷卻下逐級擴孔至1.2 mm。使用螺絲刀將鈦釘植入種植窩內，嚴密縫合(圖 1)。于右側切開黏骨膜瓣，翻瓣后縫合作為同體對照。術后5 d拆線。

圖 1 種植體及操作要點

1.2.4 取材 于實驗組種植體表面、對照組翻瓣區域黏膜愈合處作5 mm×3 mm方形切口直達硬組織表面，剝離并切取黏膜。多聚甲醛溶液固定。

1.2.5 石蠟包埋及HE染色觀察 組織標本酒精逐級脫水，放入二甲苯透明，浸蠟，頰舌向包埋。蠟塊連續切片，厚度3 μm。常規二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，HE染色，中性樹膠封片。光鏡下觀察組織學表現，感興趣區域為軟硬組織界面，隨機挑選3 個200 倍鏡下視野，使用ImageJ軟件進行炎細胞計數。

1.2.6 qRT-PCR分析牙齦組織各細胞因子基因表達 檢測IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β、IL-4、IL-13等細胞因子在牙齦組織內表達水平。各細胞因子目的基因及相應內參基因的引物序列如表 1所示，合成引物。取材時切取部分軟組織標本，置于液氮中5～10 min后取出，研磨成粉末狀，提取總RNA，計算各組細胞因子表達水平。

表 1 引物序列

1.2.7 免疫熒光染色 雙重免疫熒光法標記牙齦組織中不同表型的巨噬細胞。取連續脫鈣切片，二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，加一抗于濕盒內4 ℃孵育，NOS2與CD68抗體共標鑒別M1型巨噬細胞，CD206與CD68抗體共標鑒別M2型巨噬細胞。隔日添加熒光二抗，避光孵育2 h, DAPI標記細胞核。感興趣區域為軟硬組織界面，共聚焦顯微鏡拍照，陽性細胞計數。

1.3 統計學分析

用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析，組間比較用 One-way ANOVA，P<0.05 即統計學上具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 組織學觀察及炎細胞計數

HE染色觀察到種植體表面牙齦組織內呈現較高密度的炎細胞浸潤區域。在愈合過程中，浸潤密度有不同程度降低(圖 2)。炎細胞計數結果顯示，口腔傷口愈合， 6 周后已與正常組織無明顯差異，而實驗組的炎細胞浸潤數量始終高于對照組。愈合6 周后，種植體頂端的軟組織內呈現明顯的纖維增生(圖 3)。

2.2 種植體對牙齦組織巨噬細胞極化的影響

M1、 M2型巨噬細胞均可在不同時間點被檢出(圖 4)。陽性細胞計數顯示，實驗組各型巨噬細胞在不同時間點均表現出較對照組更高的浸潤程度。比較各組M2/M1比值顯示，愈合后4 周、 6 周時間點，實驗組M2/M1比值高于對照組及正常牙齦組織(P<0.05)。(圖 5)表明種植體表面的牙齦愈合伴隨明顯的巨噬細胞活動增強,呈現出M2型極化趨勢。

圖 5 陽性細胞計數統計結果

2.3 種植體可影響牙齦組織內細胞因子表達

各組牙齦標本細胞因子的mRNA相對表達量如圖所示。結果表明，IL-1β、 TNF-α等促炎因子在種植體周圍牙齦內的表達水平低于對照組，而在第4 周開始， IL-10、 TGF-β等與抗炎、促進修復功能相關的細胞因子，以及IL-13、 IL-4等細胞融合相關因子表達水平則高于對照組(圖 6)。

圖 6 不同愈合時間細胞因子表達情況

3 討 論

研究表明，巨噬細胞等免疫細胞及其分泌的細胞因子可直接或間接影響骨改建[8]。因此，牙齦組織內免疫環境與其所在部位的牙槽骨狀態密切相關。而鈦種植體在牙齦組織內產生的特殊免疫活動尚缺乏明確研究。Berglundh等[9]曾通過動物實驗得出結論，在菌斑控制良好的情況下種植體周圍結締組織內無炎細胞浸潤。而免疫學的觀點認為生物材料植入體內必將引起宿主異物反應并介導免疫細胞廣泛參與[10]。對此Trindade等[11]則提出，骨結合其實是異物反應平衡的表現形式，以材料周圍的慢性炎性反應為特征。本研究發現在6 周的愈合過程中牙齦內均可呈現沿種植體界面的高密度炎性浸潤帶，而口內創口在6 周即可恢復正常水平，提示種植體的存在可使牙齦組織內發生持續存在的免疫活動。Yuan等[12]也曾在植入后3周觀察到種植體周圍軟組織較高程度的炎細胞表達。本實驗通過埋入式愈合設計并延長愈合時間進一步排除細菌、傷口恢復等因素對免疫細胞浸潤所帶來的影響。此外，愈合后6 周種植體頂端牙齦可見廣泛增生的膠原纖維。有研究認為持續的慢性炎性反應與纖維增生相關[13]，而異物反應也可促使機體在材料周圍產生纖維包裹使其與正常組織相分隔[10]。因此，組織內免疫細胞的參與并不代表牙齦發生了慢性炎癥病變。

單核-巨噬細胞系統是固有免疫系統的重要組成部分，因其功能可塑性在不同的微環境影響下向M1、M2等表型極化[14]，可在傷口愈合、組織修復過程中起重要作用[15]。免疫熒光染色顯示，與正常傷口愈合相比種植體表面的牙齦組織在愈合過程中不僅展現出更高的巨噬細胞浸潤程度，而且呈現出更為明顯的M2極化趨勢。不僅M2型巨噬細胞浸潤程度高于對照組，在愈合后4 周、 6 周M2/M1的比值亦高于對照組。這與骨結合過程中巨噬細胞的極化狀態相類似，Trindade等[16]曾研究發現骨結合部位上調的巨噬細胞參與M2型極化，可在愈合后期參與更加活躍的組織修復及再生活動。

小鼠體內研究發現異物植入皮下可發生異物反應并抑制組織內促炎型細胞因子表達，產生局部免疫抑制的微環境[17]。本實驗首次探究牙齦在鈦表面愈合過程中細胞因子表達特點，顯示IL-1β、TNF-α等促炎因子顯著下調，IL-10、TGF-β等抗炎、促進修復相關的細胞因子表達上調，與小鼠皮下異物周圍的免疫環境高度類似。此外，牙齦愈合4 周、 6 周觀察到IL-4、IL-13表達水平顯著增強。這兩者已被體內、體外實驗證明具有誘導巨噬細胞融合的作用[18]，并且可被作為巨噬細胞M2方向極化的誘導因子[19]。提示牙齦愈合后期種植體表面組織內發生較高程度的巨噬細胞融合活動，而巨噬細胞融合成為異物巨細胞被認為是異物反應的標志之一。

綜上，鈦種植體表面的牙齦愈合可產生一定程度的異物反應，增強局部免疫活動，表現為較高程度的炎性浸潤及巨噬細胞M2型極化趨勢，產生利于組織修復的免疫微環境。隨著時間的進一步延長免疫系統的活動特征是否發生改變以及該免疫微環境與邊緣骨吸收之間的關系有待進一步研究。