Runx2缺失對小鼠顳下頜關節髁突軟骨細胞肥大分化以及生物力學性能的影響

廖立凡 李昱 楊琳 楊欣

顳下頜關節(temporomandibular joint, TMJ)為全身最復雜的關節之一。TMJ髁突軟骨由表及里分為纖維層、增殖層、成熟層、肥大層和鈣化層[1]。軟骨細胞是髁突軟骨中唯一的細胞類型。研究表明，軟骨細胞，尤其是肥大層軟骨細胞的一種亞類，可以轉化為髁突軟骨下骨細胞，而非之前認為的肥大軟骨細胞凋亡繼之被骨髓細胞浸入[2]。軟骨基質主要成分是II型膠原(Col2a)、蛋白多糖(aggrecan)，二者由軟骨細胞分泌[3]。

Runt相關轉錄因子-2(runt-related transcription factor-2,Runx2)是Runt轉錄因子家族成員。在成骨細胞分化過程中起著至關重要的作用[4-5]。研究表明，Runx2在軟骨細胞肥大和骨關節炎(osteoarthritis, OA)的發展中也起重要作用[6-7]。然而，有關Runx2對出生后髁突軟骨成熟分化和生物力學的作用尚不清楚。因此，本研究創建了Runx2Agc1CreER小鼠模型，研究Runx2軟骨細胞特異性刪除對出生后小鼠TMJ髁突軟骨細胞的肥大分化過程以及對其生物力學性能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

中科院深圳先進技術研究院提供Agc1-CreER和Runx2f/f小鼠，培育Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠和Agc1-CreER,Runx2flox/flox(Runx2Agc1CreER，實驗組)條件性敲除小鼠。在小鼠5 周齡時進行他莫昔芬腹腔注射(SigmaT5648, 上海，1 mg/10 g·d，持續5 d)，并在小鼠9 周齡或13 周齡時取材進行組織學分析。Cre陰性同窩小鼠(Cre-)作為對照組。每組各13 只小鼠。

1.2 Cre重組效率

為了確認Agc1-CreER小鼠可以有效靶向成年小鼠髁突軟骨細胞，將Agc1-CreER轉基因小鼠與ROSAmT/mG報告基因小鼠進行繁殖。在小鼠5 周齡時腹腔注射他莫昔芬，在小鼠9 周齡時取材并制作冰凍切片，使用熒光顯微鏡觀察冰凍組織切片。

1.3 組織學觀察

收集Runx2Agc1CreER小鼠及其對應的Cre-小鼠的TMJ。將TMJ進行固定、脫鈣、脫水、包埋等組織前期處理后，從TMJ髁突的內側，分為3 個不同的層次(相距50 μm)切下3 μm厚的矢狀連續切片，分別用蘇木精伊紅(HE)和阿爾新藍/橘紅(AB/HO)(AB/HO)方法進行切片染色。

1.4 免疫組化

將組織切片分別用抗Runx2(MBL，貨號D130-3，沃本，美國，1∶200)、ColX(Abcam，貨號ab58632， 1∶1000稀釋度)、IHH(Abcam，貨號ab39634， 1∶500)、PCNA(Abcam，貨號ab18197， 1∶4000， 英國)一抗工作液進行免疫組化染色， 4 ℃孵育過夜。

1.5 納米模量檢測

取材后將組織保存在含有蛋白酶抑制劑的4 ℃ 1×PBS中來使組織蛋白的降解最小化，然后用納米壓痕檢測技術進行檢測。納米壓痕檢測是用硼硅酸鹽膠體球形探頭和標尺對關節軟骨表面進行檢測。最后檢測的結果用彈性模量(Eind)來表示， Eind增高說明組織的承力能力增強， Eind降低說明組織的承力能力減弱。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 Agc1-CreER能夠高效靶向表達于TMJ髁突軟骨細胞

將Agc1-CreER和ROSAmT/mG轉基因小鼠進行雜交得到Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠。在小鼠5 周齡時進行他莫昔芬注射，在小鼠9 周齡和13 周齡時取材進行冰凍切片觀察。結果顯示，Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨中只有紅色熒光信號，而Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠的TMJ髁突軟骨中有廣泛的綠色熒光信號，這提示Agc1-CreER能夠高效靶向TMJ髁突軟骨細胞(圖 1)。此外，Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠髁突軟骨下骨中也出現綠色熒光信號表達。

圖 1 Agc1-CreER在髁突軟骨細胞中的表達(熒光顯微鏡, n=3)

2.2 Runx2敲除引起小鼠髁突軟骨細胞分化缺陷

HE染色顯示，Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨細胞排列有序，由表及里分為纖維層、增殖層、成熟層、肥大層、鈣化軟骨層(圖 2)；而Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨細胞的有序排列被破壞，肥大層幾乎完全缺失，增殖層和成熟層細胞密度也顯著降低(圖 2)。Cre-小鼠TMJ髁突軟骨的潮標(非鈣化和鈣化軟骨區的交界線)不明顯，而9 周齡和13 周齡Runx2Agc1CreER小鼠TMJ髁突軟骨的潮標變得非常明顯(圖 3，白色箭頭)。除此之外，阿爾新藍/橘紅染色結果表明，Runx2Agc1CreER小鼠TMJ髁突軟骨中阿爾新藍的染色強度顯著降低(圖 3)， 表明Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨免疫組化(IHC)染色評估了Runx2在Runx2Agc1CreER小鼠的TMJ髁突軟骨中的敲除效率。Cre-小鼠髁突軟骨的成熟層和肥大層中可以檢測到大量Runx2表達，而Runx2Agc1CreER小鼠的相應區域幾乎沒有Runx2的陽性表達(圖 4A)。Cre-鼠髁突軟骨層中ColX蛋白表達豐富，而Runx2Agc1CreER小鼠的相應區域ColX表達顯著降低(圖 4A)。IHH在Cre-小鼠髁突軟骨層中表達豐富，而在Runx2Agc1CreER小鼠該區域表達顯著降低。與此一致，Cre-小鼠髁突軟骨細胞可大量檢測到PCNA表達， 而Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨層細胞中PCNA的表達顯著降低(圖 4B)。

圖 2 Cre-小鼠髁突軟骨分層(HE)

圖 3 髁突軟骨蛋白聚糖表達 (HE-伊紅-阿爾新藍/橘紅染色， n=5)

圖 4 髁突軟骨中相關蛋白表達 (IHC， n=5)

2.3 Runx2敲除引起小鼠髁突軟骨彈性模量增高

在小鼠6 周齡時進行他莫昔芬腹腔連續注射5 d，劑量為1 mg/10 g。 在小鼠9 周齡后進行取材，分別對Cre-小鼠和Runx2Agc1CreER小鼠的TMJ髁突進行彈性模量(Eind)檢測(n=4)。Cre-組和Runx2Agc1CreER組的Eind(MPa)分別為0.089 8和0.762 0(P<0.05), 表明敲除出生后小鼠軟骨中Runx2基因引起小鼠的髁突軟骨硬度上升、力學性能增強。

3 討 論

髁突表面覆蓋著軟骨層，髁突軟骨層可緩沖作用于髁突上方的作用力。軟骨組織結構的改變會直接影響其力學承載能力。阿爾新藍/橘紅染色可以將蛋白聚糖或糖胺聚糖染成藍色或紫色。聚集蛋白聚糖主要位于肥大層和成熟層[8-9]。與此一致，我們發現阿爾新藍陽性染色細胞主要位于Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨的肥大層，這表明肥大層軟骨細胞是TMJ髁突軟骨中產生蛋白聚糖的主要細胞。另外，在Runx2Agc1CreER小鼠中，由于肥大軟骨層的喪失，阿爾新藍陽性染色在鈣化軟骨層中才能檢測到。

軟骨細胞過度肥大分化在OA的起始和發展中發揮重要作用[10]。在軟骨發育過程中，Runx2控制肥大層軟骨細胞的成熟和終末分化，以及軟骨內骨形成過程中的鈣化和血管浸潤[11-12]。此外，Runx2還通過軟骨細胞肥大和基質分解影響關節不穩定誘導的OA的發病過程[7,11]。軟骨細胞中Runx2的缺失降低了成年小鼠OA進展[6]。在本研究中，條件性敲除小鼠軟骨細胞中Runx2的表達抑制了軟骨細胞肥大分化，并引起增殖層軟骨細胞以及軟骨基質產生減少。這表明持續的Runx2表達對于協調和維持出生后小鼠軟骨細胞正常分化至關重要。免疫組化結果顯示，隨著Runx2的敲除，軟骨層中與軟骨細胞肥大分化相關的ColX、IHH表達均下降[13-16]。

力學性能是軟骨功能的直接指標[17-18]。有研究報道，小鼠軟骨彈性模量的降低是術后骨關節炎起始和發展的敏感指標[19],隨后髁突軟骨表面結構和其力學性能的關系也逐漸被重視[20]。本研究的生物力學檢測(髁突軟骨的彈性模量)發現，Runx2Agc1CreER小鼠的髁突軟骨彈性模量高于Cre-小鼠，表明敲除鼠的髁突軟骨硬度上升、力學性能增強。這提示，Runx2的減少在一定程度上能夠緩解TMJ-OA髁突力學性能的下降。Runx2和ColX是軟骨內成骨的重要調控因子及標志物，它們的表達水平反映了TMJ生長和改建的情況[21]。不同作用方式、作用時間的下頜前伸力差異性調節髁突軟骨細胞Runx2及ColX的表達水平。與持續性、靜止性下頜前伸力相比，間歇性、周期性下頜前伸力顯著增加了髁突軟骨Runx2及ColX表達水平[21]。而本研究Runx2軟骨敲除鼠髁突軟骨的Runx2和ColX表達降低，導致了髁突彈性模量增高，承力作用增強。這些結果表明髁突軟骨肥大分化和力學性能改變之間存在相互作用。

綜上所述，在本研究發現敲除出生后小鼠軟骨細胞Runx2導致TMJ髁突肥大軟骨層丟失，軟骨基質蛋白多糖表達降低，肥大分化相關蛋白表達降低；髁突軟骨彈性模量值上升。這表明，持續的Runx2表達能夠協調和維持出生后小鼠髁突軟骨細胞的正常肥大分化過程，對該過程的干擾會影響髁突軟骨細胞的正常分化和有序排列，以及髁突軟骨細胞的細胞外基質分泌功能，進而導致髁突力學性能改變。軟骨細胞的過度肥大分化是OA進展的重要促進因素，而且關節軟骨承力作用的下降也是OA的敏感指標[19]。因此，本研究結果也提示，如果在TMJ OA軟骨中減少Runx2的表達有可能會延緩或部分逆轉TMJ OA的髁突軟骨退變進程。