魚(yú)藤素抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

黃瑩瑩 裴浩

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)簡(jiǎn)稱(chēng)舌鱗癌，是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，同時(shí)具有很高的發(fā)病率和死亡率[1]。舌鱗癌的發(fā)病原因至今還沒(méi)有明確，大量研究認(rèn)定其發(fā)生與環(huán)境因素有關(guān)[2]。在近三十年的臨床治療中形成了以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療體系，然而舌鱗癌的五年生存率仍然處在非常低的水平，主要治療瓶頸卡在化療藥物的選擇上，當(dāng)前的大部分化療藥物都存在一定的毒副作用，所以很多患者會(huì)受到很多的額外困擾[3-4]。魚(yú)藤素(deguelin， DEG)是一種豆科植物魚(yú)藤屬的毛魚(yú)藤根莖部提取出來(lái)的擬魚(yú)藤酮類(lèi)藥物，同屬黃酮類(lèi)化合物。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤素能夠能增加多種腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放射線(xiàn)的敏感性，具有很強(qiáng)的輔助治療作用；多項(xiàng)體外研究表明魚(yú)藤素對(duì)肺癌、乳腺癌、消化道癌等多種癌癥產(chǎn)生明顯的抗癌效果[5-8]。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)藤素的抗癌作用并沒(méi)有明確的研究結(jié)論。本課題用不同濃度DEG加藥干預(yù)TSCC細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠移植瘤小鼠模型，探討?hù)~(yú)藤素對(duì)舌鱗癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物分組

CAL27細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所); HOK細(xì)胞(人正常口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞)(上海通派生物科技有限公司)，均用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于孵育箱中(37 ℃、 5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠(18～20 g， 5～6 周齡)[動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(京)2016-0006, 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司]。分為空白組、順鉑組、低劑量魚(yú)藤素組、中劑量魚(yú)藤素組和高劑量魚(yú)藤素組，每組6 只。分別用生理鹽水，30 mg/kg順鉑， 10 mg/kg魚(yú)藤素，20 mg/kg魚(yú)藤素和30 mg/kg魚(yú)藤素處理，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)： 2020-xxgnk012)。

1.2 試劑與儀器

順鉑(CAS:15663-27-1，純度≥98%)[華中海威(北京)基因科技有限公司]； DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))； 一抗和二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)； TUNEL試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)； CCK-8試劑盒(南京博研生物科技有限公司)； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)； ECL發(fā)光試劑盒(廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司)。

CQ-80L二氧化碳培養(yǎng)箱(常州金壇良友儀器有限公司)；匯松酶標(biāo)分析儀MB-580(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD有限公司，美國(guó))；Western blot電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司, 美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK-8檢測(cè)增殖 當(dāng)細(xì)胞滿(mǎn)度約為70%后換液處理，用1% FBS的DMEM孵育2 h，分成空白組、5 μmol/L DEG、 10 μmol/L DEG、 20 μmol/L DEG、 30 μmol/L DEG、 40 μmol/L DEG及50 μmol/L 8 組進(jìn)行加藥處理，設(shè)置相同濃度的順鉑組實(shí)驗(yàn)。24 h后加入15 μL CCK-8溶液， 490 nm波長(zhǎng)重復(fù)3 次測(cè)量吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)致死濃度(IC50值)。

1.3.2 Hochest/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選擇恰好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到75%左右時(shí)，加入不同濃度的魚(yú)藤素(5、10、30及50 μmol/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入Hochest/PI染色劑，隨后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況，并對(duì)其進(jìn)行拍照記錄。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將CAL27細(xì)胞接種至6 孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。按濃度為IC50的DEG分別處理CAL27細(xì)胞3、 6、12和24 h，隨后收集細(xì)胞于Tube管中， 5 000 r/min離心4～5 min，舍去上層清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將1×結(jié)合緩沖液、Annexin V-FITC及PI染料以195∶3∶2重懸細(xì)胞將細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧(ROS)水平變化 用IC50值為終濃度的DEG分別處理細(xì)胞3、 6、 12和24 h后，將細(xì)胞收集到Tube管中，PBS清洗并重懸，加入5 μL DCFH-DA并置于37 ℃ 恒溫水浴鍋中避光孵育0.5 h，離心后用PBS重懸洗滌1 次， 500 μL PBS重懸細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。隨后進(jìn)一步檢測(cè)加入ROS清除劑NAC之后DEG對(duì)CAL27細(xì)胞凋亡變化情況。

1.3.5 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型及分組藥物處理 將細(xì)胞密度為2×107/mL的CAL27以5×106個(gè)細(xì)胞/只的濃度以腋下接種的方式注入到裸鼠皮下，注入細(xì)胞后用指肚輕輕按壓注射的位置，每天觀(guān)察裸鼠及腫瘤狀況。當(dāng)接種裸鼠均出現(xiàn)直徑大5 mm3的皮下質(zhì)硬結(jié)節(jié)時(shí)，將30 只荷瘤鼠根據(jù)分組的實(shí)驗(yàn)方案，灌胃給藥，每?jī)商煲淮尾⒊掷m(xù)4 周，停藥后犧牲裸鼠并剝離腫瘤。

1.3.6 對(duì)裸鼠瘤小鼠腫瘤體積及重量的測(cè)定 隔2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體，通過(guò)公式V=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)算瘤體體積；實(shí)驗(yàn)周期完成后剝離腫瘤，記錄瘤體質(zhì)量；腫瘤抑制率計(jì)算公式為：(空白對(duì)照組瘤重均值-實(shí)驗(yàn)組瘤重均值)/空白組對(duì)照瘤重均值×100%。

1.3.7 檢測(cè)組織中的凋亡細(xì)胞狀況 OTC包埋組織，調(diào)整切片機(jī)厚度為4 μm連續(xù)切片，并參照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。在400 倍的光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)， 細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)。

1.3.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白變化 利用超聲波破碎儀將組織中的蛋白裂解出來(lái)，在4 ℃離心機(jī)中離心后取上清蛋白配樣，將蛋白通過(guò)10%～15%的SDS-PAGE凝膠分離，然后將凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜表層，將NC膜用脫脂乳封閉2 h。隨后用PBS洗去脫脂乳浮液，然后一抗加入NC膜上4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，隨后二抗室溫孵育2 h， ECL顯色，再通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、 ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAL27細(xì)胞的增殖情況

從表 1中可以看出，隨著魚(yú)藤素處理濃度的不斷提升細(xì)胞存活率逐漸降低，具有明顯的濃度依賴(lài)性，當(dāng)50 μmol/L DEG處理24 h時(shí)，細(xì)胞存活率僅為14.6%±3.3%，經(jīng)計(jì)算IC50為17.8 μmol/L；對(duì)正常口腔上皮細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示，魚(yú)藤素對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較小，當(dāng)50 μmol/L DEG處理24 h時(shí)，細(xì)胞存活率為81.3%±1.9%。

表 1 魚(yú)藤素對(duì)CAL27細(xì)胞和HOK細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 魚(yú)藤素對(duì)舌鱗癌CAL27細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

魚(yú)藤素對(duì)CAL 27細(xì)胞形態(tài)的影響如圖 1，當(dāng)處理濃度較小時(shí)，CAL27細(xì)胞體積有所增大，細(xì)胞密度逐漸變得稀疏；處理濃度增大后，CAL27細(xì)胞大量漂浮，細(xì)胞間隙明顯增大。在熒光條件下，CAL27細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度隨著魚(yú)藤素的處理時(shí)間逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果如圖 2，魚(yú)藤素處理6 h后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的凋亡，并且在處理24 h時(shí)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到最高57.5%±3.2%。同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖 3，Caspase-9和pro-caspase-3表達(dá)量降低，cleaved-caspase-3表達(dá)量升高。

圖 1 魚(yú)藤素對(duì)CAL27細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

圖 2 CAL27細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖 3 CAL27細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 魚(yú)藤素對(duì)舌鱗癌CAL27細(xì)胞的ROS調(diào)控作用

為了探究魚(yú)藤素誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞發(fā)生凋亡是否與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)， 以IC50濃度的魚(yú)藤素處理CAL27細(xì)胞不同時(shí)間(3、 6、 12及24 h)后，加入DCFH-DA熒光探針， 并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化情況。從圖 4中可以看出，隨著魚(yú)藤素處理時(shí)間的不斷增加，CAL27細(xì)胞中ROS水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性逐漸升高。在魚(yú)藤素處理后再加入ROS清除劑NAC后，細(xì)胞凋亡情況被明顯抑制，與魚(yú)藤素處理組相比具有顯著性差異(圖 5)。

圖 4 魚(yú)藤素增強(qiáng)CAL27細(xì)胞的ROS水平

圖 5 DEG和NAC對(duì)CAL27細(xì)胞凋亡的影響

2.4 魚(yú)藤素上調(diào)ROS水平調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路

Western blot結(jié)果如圖 6,魚(yú)藤素處理組的PI3K和p-AKT的表達(dá)量降低，但是當(dāng)魚(yú)藤素和NAC共同處理后，PI3K和p-AKT的表達(dá)量升高，基本恢復(fù)到與對(duì)照組相近的水平，說(shuō)明ROS處于PI3K/AKT通路的上游。

圖 6 魚(yú)藤素通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平來(lái)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路

2.5 魚(yú)藤素抑制舌鱗癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)

與對(duì)照組相比， 裸鼠移植瘤的瘤體積隨著DEG劑量的加大而明顯減小(P<0.05)，平均瘤重明顯減輕(P<0.05)(圖 7)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖 7)，隨著魚(yú)藤素處理劑量的不斷增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，具有一定的濃度依賴(lài)性(圖 7)。經(jīng)計(jì)算，DEG低、中、高劑量組腫瘤抑制率和瘤重如表 2，分別為20.1%， 56.1%和72.6%，與相同濃度的順鉑相比， DEG的腫瘤抑制效果要更強(qiáng)(P<0.05)，表明魚(yú)藤素能夠在一定范圍內(nèi)以濃度梯度來(lái)抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。

圖 7 DEG促進(jìn)裸鼠移植瘤中細(xì)胞凋亡

表 2 DEG對(duì)裸鼠移植瘤抑制率的影響

3 討 論

舌鱗癌患者的五年生存率近年來(lái)一直徘徊在50%左右，這一數(shù)字在晚期患者的身上則降為25%，已經(jīng)嚴(yán)重危害了人類(lèi)的健康和生存[9]。傳統(tǒng)的治療手段中化療特異性低，毒副作用較大，所以尋找更安全有效的化療藥物是提高舌鱗癌患者生存率和生存質(zhì)量的重點(diǎn)。魚(yú)藤素是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的Akt特異性抑制劑，對(duì)多種癌癥均具有很強(qiáng)的抗癌效果，有研究顯示，魚(yú)藤素發(fā)揮作用主要是通過(guò)抑制前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多種癌細(xì)胞的Akt(Thr308)、PTEN(Ser380)和PDK1(Ser241)的磷酸化有關(guān)，但是其上游的調(diào)控機(jī)制是如何進(jìn)行的還尚不明確[10-11]。本研究首先驗(yàn)證了魚(yú)藤素對(duì)舌鱗癌CAL27細(xì)胞的增殖抑制作用，可以看出魚(yú)藤素能夠以濃度依賴(lài)性的方式抑制CAL27細(xì)胞增殖，與陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑相比，魚(yú)藤素的增殖抑制效果要更強(qiáng)。同時(shí)驗(yàn)證其對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤素對(duì)人正常口腔上皮角質(zhì)HOK細(xì)胞的毒副作用要低于順鉑。經(jīng)計(jì)算，魚(yú)藤素對(duì)舌鱗癌CAL27細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)為17.8 μmol/L，這也與文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)其他癌癥的半數(shù)致死濃度在相近的范圍內(nèi)。

雖然臨床上常用的化療藥物具體的作用機(jī)制不盡相同，但是都有一個(gè)相同的“目的”——誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為方向來(lái)開(kāi)發(fā)抗化療藥物已經(jīng)逐漸被認(rèn)可，并發(fā)展成為腫瘤治療研究中的新熱點(diǎn)[12]。在凋亡過(guò)程中可以在顯微鏡下觀(guān)察到細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密，胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的凋亡小體。Caspase-3和Caspase-9蛋白在各類(lèi)癌的發(fā)生、發(fā)展中都起著十分重要作用[13]。在凋亡過(guò)程中，pro-caspase-3會(huì)被剪切成具有執(zhí)行功能的cleaved-caspase-3執(zhí)行凋亡“任務(wù)”。本研究雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步看出，魚(yú)藤素能夠改變CAL27細(xì)胞形態(tài)，隨后的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證明了魚(yú)藤素能夠誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，并進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從分子水平上證明了魚(yú)藤素的誘導(dǎo)凋亡能力。

當(dāng)癌細(xì)胞中的ROS水平過(guò)高后會(huì)直接調(diào)控細(xì)胞中的多條信號(hào)通路及多個(gè)信號(hào)因子，細(xì)胞中的多種生理進(jìn)程會(huì)因此而改變，其中就包括細(xì)胞凋亡[14]。在魚(yú)藤素處理后，CAL27細(xì)胞中的活性氧水平逐漸升高，并且具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性，為了驗(yàn)證ROS水平上升是否和凋亡有關(guān)，加入了NAC后繼續(xù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，可以看出NAC大幅降低了魚(yú)藤素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例。PI3K/AKT通路是一條經(jīng)典的信號(hào)通路，魚(yú)藤素被認(rèn)為是Akt抑制劑，但是魚(yú)藤素是怎樣調(diào)控Akt信號(hào)通路的還尚不明確，在查閱了大量文獻(xiàn)后得知ROS可以直接調(diào)控Akt的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控整條PI3K/AKT信號(hào)通路[15-16]。所以為了驗(yàn)證魚(yú)藤素是否是通過(guò)上調(diào)ROS水平來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Akt通路的抑制的，加入NAC檢測(cè)Akt通路蛋白的表達(dá)，可以看出魚(yú)藤素和NAC共同處理組的p-Akt和PI3K表達(dá)量要遠(yuǎn)高于魚(yú)藤素單獨(dú)處理組，說(shuō)明調(diào)控ROS水平是魚(yú)藤素發(fā)揮Akt抑制劑作用的關(guān)鍵要素。

體內(nèi)裸鼠瘤實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證藥效和檢測(cè)毒副作用的關(guān)鍵，有研究表明30 mg/kg順鉑對(duì)大部分瘤體的生長(zhǎng)抑制較強(qiáng)，因此本研究同樣選取了30 mg/kg順鉑為陽(yáng)性對(duì)照組。從結(jié)果中可以看出魚(yú)藤素能夠抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并且具有一定的濃度依賴(lài)性，相同濃度下對(duì)瘤體的抑制效果要強(qiáng)于順鉑，30 mg/kg的魚(yú)藤素對(duì)瘤體的抑制率高達(dá)72.6%，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小鼠沒(méi)有死亡，體重也沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明魚(yú)藤素的體內(nèi)毒副作用較小。

綜上所述，Akt抑制劑魚(yú)藤素對(duì)舌鱗癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制增殖作用，其作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中ROS水平，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，最終引起舌鱗癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，為中藥魚(yú)藤素在舌鱗癌中的應(yīng)用提供了一定的基礎(chǔ)。