lncRNA HOXA11-AS通過EZH2/TFPI2途徑調控OSCC的機制研究

張夢葩 曹代娣 景帆 李苗 劉艷

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一種常見的口腔惡性腫瘤，其特征是局部浸潤和頸部轉移率高，術后易復發，預后差[1]。在過去幾十年里，OSCC患者的總體生存率并沒有顯著提高， 5 年生存率僅為50%～60%[2-3]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)被報道在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因表達[4]，以癌基因或腫瘤抑制因子參與多種生理和病理過程，它的異常表達與癌癥預后密切相關[5]。lncRNA可以通過影響RNA聚合酶II的募集或誘導染色質結構重構來調控基因表達[6]，或者與蛋白質相互作用，影響蛋白活性或定位[7]。同源框A11反義RNA(HOXA11-AS)已被證實參與胃癌[8]、肝癌[9]、肺癌[10]等多種癌癥的進展，在OSCC中，HOXA11-AS被報道參與調控細胞增殖[11]和順鉑耐藥[12]。

lncRNA可以通過與多梳復合體(polycomb repressive complex 2，PRC2)結合而實現沉默基因表達[13]。組蛋白甲基化轉移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是PRC2的關鍵催化亞基(EZH2, SUZ12)，增強核小體組蛋白H3亞基27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)從而抑制基因表達[14-16]。

本研究檢測了HOXA11-AS和TFPI2在OSCC中的表達，以及沉默HOXA11-AS或過表達TFPI2后SCC-25細胞的生物學功能變化，通過RIP和ChIP等技術研究HOXA11-AS、EZH2和TFPI2之間的相互關系，旨在闡釋HOXA11-AS在OSCC進展中的作用及調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HOXA11-AS，EZH2和TFPI2的小干擾RNA及陰性對照(北京百奧森泰生物技術有限公司); Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，美國); TaqMan RNA Reverse Transcription試劑盒、TaqMan Universal PCR kit(Applied Biosystem，美國)； RNeasy mini kit、 Qproteome Mammalian Protein Prer kit(QIAGEN，德國)； GAPDH、EZH2、SUZ12、TFPI人源單克隆抗體(Upstake，美國)； Transwell小室(Greiner公司，美國)； CCK-8和細胞凋亡檢測試劑盒(BD，美國)。

1.2 臨床組織樣本獲取和細胞培養

西安大興醫院口腔科38 例OSCC患者的腫瘤組織和癌旁組織，獲取新鮮樣本保存于-80 ℃。患者術前未接受過放療、化療等手段的干預。本研究經西安大興醫院倫理研究委員會批準，所有患者簽署了知情同意書。

人正?？谇唤琴|化細胞(NHOK)和OSCC細胞系(SCC-25)購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所(上海)， 置于DMEM培養基中(含10%胎牛血清， 100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，在含5% CO2的恒溫培養箱中37 ℃培養。

1.3 細胞轉染

將SCC-25細胞接種于6 孔板，培養至細胞融合率達到60%～80%時進行轉染。使用脂質體Lipofectamine 2000 分別轉染過表達pcDNA3.1-TFPI2的質粒(TFPI2)和空質粒pcDNA3.1-NC(pcDNA)，轉染濃度為300 nmol/L。si-HOXA11-AS、si-EZH2、si-TFPI2等小干擾RNA (siRNA)，轉染濃度為100 nmol/L，陰性對照為si-NC。轉染48 h 后，RT-qPCR檢驗轉染效率。

1.4 RT-qPCR檢測

使用TRIzol試劑從組織和細胞中提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA。采用熒光定量PCR儀，以SYBR Green (Roche)在StepOnePlusTM系統進行RT-qPCR反應，采集熒光并進行分析。U6和GAPDH作為內參， RNA的相對表達通過2-ΔΔCt公式計算。

1.5 蛋白印跡分析

用RIPA裂解液提取OSCC組織和細胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。用12%的SDS-PAGE分離蛋白并轉移至PVDF膜上。膜與稀釋后的一抗EZH2(1∶1000)、SUZ12(1∶1000)、TFPI2(1∶1000)4 ℃共孵育過夜；第二天， 將膜與相應標記的二抗(1∶600)室溫孵育1 h后用ECL試劑在凝膠成像系統中檢測蛋白信號，用Image J 對蛋白條帶定量分析。

1.6 亞細胞分離定位

使用PARIS 試劑盒分離SCC-25細胞核和細胞質組分。采用RT-qPCR檢測細胞質和細胞核中HOXA11-AS的RNA水平。GAPDH為細胞質對照，U6為細胞核對照。

1.7 RNA免疫沉淀(RIP)

使用EZ-Magna RIP試劑盒進行RIP分析。SCC-25細胞在10 cm平板中生長，通過離心收集細胞，并在RIP裂解緩沖液中裂解，使得100 μL的裂解液含有1×107個細胞。細胞裂解液和抗體EZH2，SUZ12，IgG以及磁珠在4 ℃孵育過夜。然后，洗滌珠子并與蛋白酶K孵育以除去蛋白質。最后，使用特異性引物對純化的RNA進行RT-qPCR檢測。

1.8 RNA下拉分析

使用TranscriptAid T7高產量轉錄試劑盒體外轉錄HOXA11-AS，用生物素標簽標記HOXA11-AS序列，然后用RNase-free DNase I處理DNA，用RNeasy Plus Mini試劑盒純化。SCC-25細胞加入裂解液裂解1 h。隨后，生物素標記的RNA與磁珠混合，與細胞裂解液孵育在4 ℃孵育6 h。最后，將珠子洗凈，用Western blot分析洗脫后的蛋白。

1.9 染色質免疫沉淀(ChIP)

細胞與1%甲醛交聯，收集細胞，超聲裂解。然后，將細胞裂解液與針對EZH2、H3K27me3或對照IgG的抗體，以及瓊脂糖珠(Anti-Flag)4 ℃孵育過夜。孵育完成后，用預冷的TBS緩沖液洗滌瓊脂糖珠?；厥粘恋淼娜旧|DNA，使用RT-qPCR進行檢測。

1.10 細胞增殖和侵襲實驗

轉染48 h后，將OSCC細胞接種于96 孔板進行培養，根據制造商的說明書分別在24、 36、 48、 60和72 h向每孔加入20 μL CCK-8試劑， 37 ℃下孵育2 h， 450 nm波長處檢測吸光度值。

1.11 細胞侵襲分析

制備Transwell小室基質膠，在上室加入100 μL無血清培養基，下室加入含有10%胎牛血清的培養基600 μL，將1×105的SCC-25細胞接種于上室，培養24 h后用40%的多聚甲醛固定， 0.1%的結晶紫染色，顯微鏡下觀察穿過小孔細胞數目，并拍照記錄。

1.12 細胞凋亡實驗

將SCC-25細胞以1×105接種于6 孔板，轉染后培養48 h，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌。之后將細胞胞分散在1 mL可滲透膜的碘化丙啶(50 μg/mL)中，并在黑暗中于4 ℃孵育20 min，采用流式細胞術觀察細胞凋亡數量。

1.13 統計學分析

2 結 果

2.1 HOXA11-AS沉默抑制OSCC細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡

SCC-25細胞在轉染了si-HOXA11-AS后，HOXA11-AS的表達顯著降低(圖 1)。沉默HOXA11-AS后會顯著抑制SCC-25細胞的增殖和侵襲能力(圖 1)，誘導細胞凋亡(圖 1)。

圖 1 沉默HOXA11-AS對OSCC細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡的影響

2.2 在SCC-25細胞中HOXA11-AS通過與EZH2結合抑制TFPI2轉錄

亞細胞定位發現HOXA11-AS主要位于SCC-25細胞核中，可以直接與EZH2蛋白相互結合，敲除EZH2后，TFPI2的mRNA和蛋白表達均顯著上調(圖 2)，TFPI2啟動子區域EZH2和H3K27me3的富集減少，尤其是EZH2的富集顯著減少(圖 2)。

圖 2 在OSCC-25細胞中HOXA11-AS通過與EZH2結合抑制TFPI2的轉錄

2.3 過表達TFPI2對OSCC-25細胞的增殖、侵襲和凋亡的影響

過表達TFPI2的SCC-25細胞中TFPI2的mRNA和蛋白表達量顯著升高，細胞增殖能力顯著減弱，侵襲數顯著減少(圖 3)，細胞凋亡被誘導(圖 4)。

圖 3 過表達TFPI2抑制OSCC-25細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡

2.4 HOXA11-AS通過沉默OSCC-25中的TFPI2發揮致癌活性

si-HOXA11-AS沉默后HOXA11-AS的表達量顯著降低，而HOXA11-AS沉默誘導的TFPI2表達增加被TFPI2的敲除所抑制(圖 4)。此外，我們還發現，沉默HOXA11-AS抑制了SCC-25細胞的增殖、侵襲，誘導了細胞凋亡，但這種作用在沉默TFPI2后消失。

圖 4 HOXA11-AS通過沉默OSCC中的TFPI2發揮致癌活性

3 討 論

HOXA11-AS是lncRNA的一種新型生物標志物，已被報道在多種癌癥中上調并促進腫瘤進展。在研究中，OSCC組織和細胞系中HOXA11-AS的表達水平顯著上調，敲除HOXA11-AS可顯著抑制OSCC細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡。與本研究一致的是Chen等[10]發現在非小細胞肺癌中HOXA11-AS表達上調，預后不良。Liu等[8]發現，HOXA11-AS可以促進胃癌細胞周期進展、遷移和侵襲。因此，本研究確定HOXA11-AS是作為一種促癌因子參與了OSCC的調控，但其調控機制仍不清楚。

亞細胞分級檢測，發現HOXA11-AS主要位于細胞核部分，在轉錄水平上調控靶基因。此外，還發現HOXA11-AS可以直接與EZH2結合。而在許多惡性腫瘤中，EZH2的異常表達被報道與多種細胞過程相關，在舌鱗癌中EZH2的表達陽性率為77.0%[17]。推測HOXA11-AS參與OSCC發病過程是通過EZH2實現的。

本研究將SCC-25細胞中的HOXA11-AS敲除，TFPI2 的表達上調，而沉默EZH2后，TFPI2 的表達也顯著升高,表明TFPI2是OSCC細胞中XOXA11-AS的一個新靶點。而EZH2通過催化核小體組蛋白H3亞基27位懶氨酸的三甲基化(H3K27me3)負調控轉錄，HOXA11-AS可以通過介導H3K27me3修飾將EZH2募集到TFPI2啟動子區域，并抑制其轉錄。這一發現與之前在非小細胞肺癌、結腸癌和肝癌[9]中的研究報道一致，HOXA11-AS通過與表觀遺傳蛋白(如EZH2、LSD1、CBP)相互作用，部分抑制下游靶點的轉錄，從而發揮致癌作用。

組織因子途徑抑制劑2(TFPI2)作為抑癌因子在膀胱癌[18]、結腸癌[19]、乳腺癌[20]等多種腫瘤中發揮活性。本研究中，TFPI2在OSCC組織和細胞中呈低表達狀態，過表達TFPI2降低OSCC細胞的增殖和侵襲能力，誘導細胞凋亡。這與之前的報道結果一致，TFPI2在OSCC患者和細胞內表達下調，過表達TFPI2能夠延長患者的生存期[21]，降低OSCC的侵襲性，干擾細胞轉移[22]。研究還發現沉默TFPI2能夠逆轉HOXA11-AS敲低誘導的SCC-25細胞抗增殖、抗侵襲和促凋亡作用。

總之，HOXA11-AS可以通過結合招募EZH2來沉默TFPI2，從而促進OSCC細胞的增殖和侵襲，抑制細胞凋亡，促進OSCC的進展。HOXA11-AS的發現為OSCC治療提供了一個潛在的分子治療靶點。