DNA甲基化位點對肺腺癌預后的作用研究

劉穎方子晗張雅琴王可,3

1 廣州市第一人民醫院(廣州 510180) 2 湖北文理學院基礎醫學院預防醫學教研室(襄陽441053) 3 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院，臨床循證與轉化醫學中心(襄陽441053)

肺癌是世界上最常見的癌癥，也是癌癥死亡的最常見原因[1]。作為肺癌的主要類型之一，非小細胞肺癌約占肺癌病例的85%，非小細胞肺癌以肺腺癌居多[2]。目前因早期診斷工具及常見的腫瘤標志物對非小細胞肺癌不敏感，導致肺腺癌預后相對較差，5年生存率不足15%[3-4]。因此，為提升肺腺癌病人的預后生活質量，探索與肺腺癌有關的生物標志物尤為重要。

表觀遺傳學改變與肺癌發病、病程加快相關，DNA甲基化(DNA methylation)是導致表觀遺傳學改變的關鍵因素，在細胞功能調控和癌變過程中占據重要作用[5-7]。研究表明，DNA甲基化通過調控lncRNA的表達從而影響肺癌的預后[8]。腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)含有大量腫瘤信息，為研究不同腫瘤共性、突變性、差異性情況提供機會[9]。本文從TCGA中選取肺腺癌甲基化數據，篩選與其預后相關甲基化位點，并評估肺腺癌病人預后情況，初步探索DNA甲基化在肺腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 數據來源

本研究使用TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)對數據進行篩選，包括肺腺癌mRNA表達數據、甲基化數據和臨床預后數據。2019年10月本研究在TCGA數據庫下載肺腺癌mRNA表達數據和甲基化數據，其中具有癌組織和癌旁組織甲基化信息數據的合計26例，具有癌組織和癌旁組織mRNA表達數據的患者合計56例。經過數據連接處理后，具有癌組織甲基化芯片數據和mRNA表達數據的病人合計455例，具有臨床預后信息和癌組織甲基化芯片數據的患者合計418例。

1.2 肺腺癌風險相關甲基化位點的篩選

在對組學數據進行預處理后，篩選差異性甲基化位點和差異性mRNA表達的基因(錯誤發現率(false discovery rate, FDR)<0.05且差異倍數(fold change)>2或<0.5)，并選擇甲基化、mRNA表達水平具有顯著性關聯的甲基化位點進行后續分析(P<0.05且R2>0.2)。共篩選出158個差異性甲基化位點。

將418例肺腺癌病人隨機分成兩組，一組為探索人群(251人，60%)，一組為驗證人群(167人，40%)。在探索人群中采用最小絕對收斂和選擇算子(Least absolute shrinkage and selection operator, LASSO)篩選對肺腺癌風險有影響的甲基化位點，并在驗證人群中對前期篩選出的甲基化位點進行結論驗證。

1.3 相關甲基化位點與肺腺癌風險之間的關系

線性相關方法用于分析甲基化位點甲基化水平、肺腺癌之間的關聯性，非條件Logistic回歸模型評估甲基化位點與肺腺癌預后的關系。同時運用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析評估甲基化位點對肺腺癌風險的預測效果。

1.4 統計學分析方法

應用GraPad Prism 5、SAS 9.4軟件、R 3.3.0軟件開展數據分析和繪圖。t檢驗比較兩樣本均數差異，P<0.05為有統計學差異。

圖1 本研究數據篩選流程圖

2 結 果

2.1 納入對象基本臨床特征

符合條件的肺腺癌病人共有418例。研究人群平均年齡(65.10±10.14)歲，術后化療病人152人(36.4%)、放療病人88人(21.1%)，在隨訪結束時有102人死亡，占比24.4%。

2.2 肺腺癌風險相關甲基化位點的篩選結果

將418例肺腺癌病人隨機分成兩組，一組為探索人群(251人，60%)，一組為驗證人群(167人，40%)。在對數據進行預處理后，根據篩選標準，最后共有158個甲基化位點在癌和癌旁組織中具有顯著差異且與其所在基因mRNA表達顯著相關。圖2展示了使用LASSO回歸的分析結果，當模型最優時，僅有cg19378330甲基化位點納入模型。cg19378330在TCGA數據庫的注釋信息顯示其所在基因為ABCC2。

圖2 LASSO回歸篩選與肺腺癌預后有關的甲基化位點

圖3 56例肺腺癌病例的癌組織和癌旁組織中前50個差異表達基因熱圖情況

2.3 生物信息學分析

圖3為前50個顯著性差異甲基化位點和基因無監督聚類分析，結果顯示在肺腺癌病人的癌和癌旁組織中，甲基化位點的甲基化水平及所在基因mRNA表達水平有較大差異。基因GO(Gene ontology)富集性分析顯示，基因可以被分為23個功能聚類，其中有13個P<0.05的GO功能分類。主要參與G蛋白偶聯受體介導的信號通路、細胞生長負調控蛋白等蛋白調控功能，膜的生物發生、膜筏組織調控等細胞相關功能，以及影響粘著斑結構功能等生物學過程(圖4)。

圖4 前50個差異甲基化位點基因GO分析結果

2.4 甲基化位點與肺腺癌風險的關聯性分析

甲基化位點cg19378330的甲基化水平對肺腺癌死亡風險的影響見表1和表2。結果顯示，在探索階段人群中，位點cg19378330甲基化水平增加，肺腺癌死亡風險增高(OR=9.82, 95%CI=1.84～52.48)。甲基化位點水平高于中位數的患者，歸入高風險組，甲基化位點低于中位數的為低風險組。結果發現與低風險組相比，高風險組的死亡風險比低風險組增加了38%(OR=1.38, 95%CI=1.16～2.69)。在驗證人群中表現出相似結果。

表1 甲基化位點cg19378330的甲基化水平與肺腺癌之間的關系(探索人群)

表2 甲基化位點cg19378330的甲基化水平與肺腺癌之間的關系(驗證人群)

2.5 甲基化位點與肺腺癌病人風險的預測價值評估

采用ROC曲線分析評估甲基化位點cg19378330對肺腺癌風險的預測效果結果顯示，在探索階段人群中其ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)的結果為0.80(0.73～0.88)，靈敏度為86.2%。在驗證人群中，甲基化位點cg19378330的甲基化水平與肺腺癌風險之間的關系更為顯著(表2)。與低風險組肺腺癌病人相比，高風險組病人的風險明顯增加(OR=3.62, 95%CI=1.53～8.56)。ROC曲線分析顯示AUC為0.81(0.73～0.89)，靈敏度為90.1%。甲基化位點cg19378330與其所在基因ABCC2 mRNA表達水平之間的關系見圖5。上述研究結果表明，甲基化位點cg19378330與肺腺癌具有較顯著的關聯性，且可以對肺腺癌的風險進行有效的預測。

圖5 肺腺癌病人癌組織、癌旁組織中甲基化和基因mRNA表達水平

3 討 論

本文利用TCGA公共數據庫中肺腺癌有關數據，篩選出1個甲基化位點(cg19378330)與肺腺癌風險相關。依據甲基化位點中位數進行分組，高于甲基化位點水平中位數的，歸入高風險組，低于甲基化位點中位數的為低風險組，高風險組死亡風險是低風險組的1.38倍。采用ROC曲線分析評估甲基化位點cg19378330對肺腺癌風險的預測效果結果顯示，AUC為0.80，靈敏度為86.2%。且在驗證人群中表現出類似結果。提示甲基化位點cg19378330與肺腺癌具有較顯著的關聯性，且可以對肺腺癌的風險進行有效的預測。

cg19378330位于10號染色體99840130-99840469的CpG島序列，為基因ABCC2的gene body區。ABCC2全稱為三磷酸腺苷結合盒轉運體C2(ATP-binding cassette transporters C2, ABCC2)，是一種屬于ABC轉運體C亞家族的膜轉運蛋白[10, 11]。ABCC2可以激活三磷酸腺苷酶，在水解ATP獲取能量后將底物泵出，因此在藥物吸收、分布、排泄過程中發揮重要作用[12]。同時，ABCC2基因在人體內存在著遺傳變異現象，其多態性可影響腫瘤細胞編碼蛋白的表達和功能[13]。有研究結果顯示，ABCC2的基因過表達及變異情況可以作為預測非小細胞肺癌預后情況的有效生物標志物，且ABCC2的基因表達水平與非小細胞肺癌病人的化療效果有關[14-15]。非小細胞肺癌最常使用鉑類化療，ABCC2蛋白轉移鉑類藥物與還原型谷胱甘肽的結合物，降低細胞內藥物濃度從而使非小細胞肺癌病人產生耐藥，影響化療效果[16-18]。在肺腺癌病人中，cg19378330位點顯示為高甲基化狀態，且與基因ABCC2的表達相關，結果表明cg19378330可能通過調節自身甲基化狀態從而影響ABCC2基因的表達，進而影響肺腺癌的發病及預后。

本研究具有一定的創新性和科學價值。第一，在TCGA數據庫選擇有顯著性差異的與肺腺癌風險相關的甲基化位點cg19378330，提出甲基化水平改變與肺腺癌風險之間存在潛在關聯的研究假設，國內外未見此甲基化位點的類似報道；第二，通過對公共組學數據庫進行挖掘，證明甲基化位點與肺腺癌預后風險的評估效果，研究結論可以為腫瘤的個性化治療提供新的探索方向。

綜上所述，通過TCGA數據庫挖掘，篩選出肺腺癌相關的特異性甲基化位點cg19378330，且甲基化位點cg19378330對肺腺癌病人的預后有較好預測價值，為肺腺癌預后提供更多可供選擇的標志物。