干制扇貝柱多糖熱水輔助酶解法提取工藝優(yōu)化

薛 蕊，孫 莉， 李智博

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023；2.大連理工大學(xué)附屬學(xué)校圣克拉校區(qū)，遼寧大連 116023）

0 引言

海灣扇貝（Argopecten irradians）是一種重要的經(jīng)濟(jì)海洋貝類(lèi)，屬于軟體動(dòng)物門(mén)，扇貝科。作為一種具有滋陰補(bǔ)腎功效的營(yíng)養(yǎng)保健品而深受消費(fèi)者青睞[1]。據(jù)報(bào)道，扇貝富含蛋白質(zhì)、多糖和礦物質(zhì)[2-6]。近年來(lái)，有關(guān)研究證實(shí)貝類(lèi)多糖在抗腫瘤、保肝、抗病毒和抑菌等方面均有一定效果[7-10]，因而成為重要的功能食品資源[11]。

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量較高，蛋白質(zhì)和多糖在干燥過(guò)程中會(huì)發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，對(duì)于多糖功能活性的影響比較大[12]。扇貝具有季節(jié)性強(qiáng)、不易貯藏的特性。因此，干制成為扇貝食用和貯藏的主要手段?，F(xiàn)階段扇貝干燥的研究主要集中在干燥效率、產(chǎn)品外觀和復(fù)水率等方面[13-15]，且多糖的提取工藝多集中于植物或中藥材[16-17]，對(duì)于干制水產(chǎn)品多糖的提取工藝報(bào)道比較少。

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化熱水輔助酶解法提取干制扇貝柱多糖的工藝，為干制扇貝的營(yíng)養(yǎng)與加工開(kāi)發(fā)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海灣扇貝柱，大連玉洋集團(tuán)有限公司提供；木瓜蛋白酶（10 萬(wàn)U/g）、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、95%乙醇，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

固形物計(jì)，日本ATAGO 公司產(chǎn)品；DS-1 型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；SB-120D 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；RE-5203 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器產(chǎn)品；SHZ-D 型循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電氣有限公司產(chǎn)品；GI21M 型湘儀離心機(jī)，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠產(chǎn)品；FD-1 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；SYNERGY HI 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干貝柱的制備

取新鮮扇貝柱于2 倍質(zhì)量的水中，待水沸騰后加入6%（V/W）鮮貝柱質(zhì)量的鹽于鍋中蒸煮6 min，撈出瀝水后將煮制扇貝于60 ℃烘箱中干燥40 min，取出后晾曬至水分活度15%～20%。

1.3.2 干貝柱多糖的提取工藝流程

新鮮貝柱→烘干→破壁→熱水浸提處理→離心、濃縮→乙醇沉淀→揮醇→木瓜蛋白酶酶解處理→離心、醇沉→揮醇→扇貝粗多糖提取液→凍干→測(cè)定。

1.3.3 干貝柱多糖熱水浸提條件的優(yōu)化

熱水浸提正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 熱水浸提正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

由表1 可知，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化熱水法提取干貝柱多糖的工藝，選用不同料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度的條件，獲得的浸提液加入3倍體積95%乙醇，于4 ℃下醇沉過(guò)夜，收集沉淀，揮醇后冷凍干燥，測(cè)定多糖純度。

1.3.4 木瓜蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

超聲醇沉后的溶液調(diào)整固形物為10%，采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解[18]。優(yōu)化因素為酶解時(shí)間（1，2，3，4，5 h），酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃），加酶量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%），酶解pH 值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）。固定條件為酶解時(shí)間3 h，酶解溫度50 ℃，pH 值7.0，加酶量2%。醇沉后冷凍干燥，測(cè)定多糖純度。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定酶解時(shí)間為3 h 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[19]，進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝。選擇響應(yīng)面試驗(yàn)中的最適項(xiàng)并綜合，按上述方法二次醇沉，收集沉淀，冷凍干燥后即得干貝柱粗多糖。

酶解提取多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 酶解提取多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 干貝柱多糖純度的測(cè)定

用苯酚-硫酸法[20]測(cè)定干燥貝柱多糖含量，選擇葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定3 組平行取平均值。純度的計(jì)算公式為：

式中：m0——樣品溶液中葡萄糖含量，mg；

n——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

m——干燥的扇貝多糖的質(zhì)量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析，顯著性水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水浸提正交試驗(yàn)結(jié)果

熱水浸提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，熱水浸提正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表4。

表3 熱水浸提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 熱水浸提正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

由表3 與表4 可知，熱水浸提3 個(gè)因素中浸提時(shí)間影響最為顯著，各因素對(duì)多糖純度的影響程度順序依次為浸提時(shí)間（B）＞浸提溫度（A）＞料液比（C）。最優(yōu)工藝為A2B2C3，即浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間4 h，料液比1∶40（g∶mL）。3 次平行試驗(yàn)浸提液多糖純度為26.92%±0.94%。

2.2 木瓜蛋白酶酶解條件單因素優(yōu)化結(jié)果

木瓜蛋白酶酶解條件對(duì)干貝柱多糖純度的影響（n=3）見(jiàn)圖1。

圖1 木瓜蛋白酶酶解條件對(duì)干貝柱多糖純度的影響（n=3）

由圖1 可知，隨著酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量、pH 值的增加，干貝柱多糖純度均呈先上升后下降的趨勢(shì)。酶解時(shí)間3 h，溫度溫度55 ℃，加酶量2%，pH 值7.0 表現(xiàn)出最佳酶解效果，多糖純度分別為44.5%±0.74%，46.71%±0.66%，44.72%±0.87%，43.56%±0.65%。

2.3 木瓜蛋白酶酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

以干貝柱多糖提取物的多糖純度為試驗(yàn)指標(biāo)，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0，根據(jù)Box-behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，回歸模型的方差分析見(jiàn)表6。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表6 可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ虵 值很高而p 值極低（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著，該模型R2為0.997 3，說(shuō)明模型高度顯著并可以用于分析預(yù)測(cè)酶解工藝條件。另外，由表6 可知，A'、B'、A'2、B'2、C'2對(duì)多糖純度影響極顯著（p＜0.000 1），C'對(duì)多糖純度影響顯著（p＜0.05）；其他因素的影響不顯著。干貝柱多糖提取物的多糖純度（Y），酶解溫度（A'）、pH值（B'）、加酶量（C'）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表6 回歸模型的方差分析

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖2。

通過(guò)圖2 可以預(yù)測(cè)、檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值，同時(shí)可以確定變量之間的相互關(guān)系，響應(yīng)面越陡峭，等高線(xiàn)呈橢圓形表示交互作用越顯著[21]。

由圖2 可知，酶解溫度（A'）、pH 值（B'）、加酶量（C'）對(duì)多糖純度的影響均很明顯，而pH 值與加酶量的交互作用（B'C'）要明顯于pH 值與酶解溫度（A'B'）、溫度與加酶量（A'C'）的交互作用，符合方差分析結(jié)果。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖

2.3.3 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert 8.0 軟件分析，得到酶解提取干貝柱多糖的最佳條件為酶解溫度57.8 ℃，酶解pH值7.07，加酶量1.98%，提取物的多糖純度達(dá)到48.80%。根據(jù)實(shí)際情況修正最佳條件為酶解溫度57.8 ℃，酶解pH 值7.1，加酶量2%。根據(jù)修正條件進(jìn)行3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，得多糖純度為48.62%±0.79%，與理論預(yù)測(cè)值較接近，證明結(jié)果可信度高。

3 結(jié)論

干貝柱多糖提取的最佳工藝為浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間4 h，料液比1∶40（g∶mL），酶解溫度57.8 ℃，pH 值7.1，加酶量2%，在此工藝下提取的多糖純度為48.62%±0.79%。