不同形態氮添加對毛竹林土壤N2O排放的影響

蔣文婷，田立斌，朱高荻，唐榮貴，林永新，潘靈強，蔡延江*

（1 浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江杭州 311300；2 浙江農林大學環境與資源學院，浙江杭州 311300；3 浙江省安吉縣靈峰寺林場，浙江安吉 313302；4 福建師范大學地理科學學院，福建福州 350007）

氧化亞氮(N2O)是大氣中僅次于二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)的第三大溫室氣體，百年尺度上單分子N2O的增溫潛勢(GWP)是CO2的265倍[1]，其對全球變暖的貢獻約占6%[2]。除溫室效應外，N2O還能在平流層中被進一步氧化為一氧化氮(NO)，進而破壞臭氧層[3]。土壤中排放的N2O占全球總排放量的57%左右[4]，森林土壤N2O排放量約為2.4～5.7 Tg/年[5-6]。工業革命以來，人類活動導致大氣氮沉降出現迅猛增長[7]，相應地增加了陸地生態系統氮的可利用性，進而使得N2O排放加劇。

土壤N2O主要是通過硝化和反硝化過程產生的[8]，這兩個過程主要受土壤氮素形態、有效氮含量以及硝化和反硝化微生物等因素的影響[9-11]。不同環境下，主導土壤N2O產生的微生物過程差異較大，北方森林地區土壤水分適中且銨根離子(NH4+)富集，硝化作用支配著土壤N2O的排放[12]；而熱帶森林和亞熱帶森林地區由于雨水充足易形成厭氧環境且硝酸根離子(NO3-)相對富集，反硝化被認定為土壤N2O的主要產生過程[13]。硝化作用主要由氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌驅動完成，其中NH3氧化成NO2－是硝化作用的限速步驟，由氨氧化細菌(ammoniaoxidizing bacteria, AOB)、氨氧化古菌(ammoniaoxidizing archaea, AOA)的氨單加氧酶催化完成，因此氨氧化菌的研究常利用amoA基因豐度表征其分布水平[14]，而不同生態系統中AOA和AOB對硝化作用的貢獻差異較大[15]，N2O通常被認為是硝化過程的副產物。反硝化過程需通過硝酸鹽還原酶(nitrate reductase，Nar)、亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，Nir)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase，Nor)和氧化亞氮還原酶(nitrous oxide reductase，Nos)的作用將NO3－還原為N2，N2O則是這一過程的中間產物[16]。研究表明，氮沉降會顯著影響硝化菌和反硝化菌[17-18]。低氮添加能顯著增加AOA、nirS、nosZ基因豐度，但過量氮添加由于其鹽離子的毒害作用以及酸化作用會降低AOA、nirS、nosZ基因豐度[19]。也有研究顯示，氮添加顯著增加了nirK基因的豐度，但顯著降低了nosZ基因的豐度[20-21]，他們認為，nirK基因豐度的增加是由于NO3-的累積造成的。Nos的編碼基因nosZⅠ通常被認為是編碼N2O還原酶的唯一功能基因，但近期發現了另一個分支nosZⅡ，這一發現進一步深化了氮循環研究，且nosZⅡ基因也廣泛存在于土壤中[22]，它們對減少土壤溫室氣體排放有重要作用。反硝化功能基因nirS和nirK與nosZⅠ和nosZⅡ之間的平衡關系，可以在一定程度上反映出土壤N2O的排放能力[23]。

毛竹(Phyllostachys edulis)是我國亞熱帶地區的代表性竹種和重要的森林資源，其速生特性及較高的凈生態系統生產力使得它在固碳及緩解氣候變暖方面發揮著重要作用[24]。我國現有毛竹林面積為467.78萬hm2，占竹林總面積的72.96%[25]。短期內的N沉降輸入有利于提高毛竹林系統的初級生產力及穩定性[26]，但對于N沉降形勢嚴峻、土壤N相對富集的亞熱帶毛竹林生態系統而言，可能存在著嚴重的負面效應，如土壤酸化、生物多樣性減少、N2O排放增加等[27-28]。目前氮沉降研究中大多僅注重單一含氮化合物(比如硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀)的影響[29]，關于不同形態氮對N2O排放的影響還尚無定論，而且各種氮對應的陰/陽離子(KNO3-K+、NH4Cl-Cl－)如何影響土壤N2O排放也鮮有報道。因此，綜合探討不同形態氮及對應陰/陽離子對亞熱帶毛竹林土壤N2O排放的影響，對于深入理解我國森林土壤N2O排放對大氣N沉降的響應機制尤為重要。有研究顯示，銨態氮(NH4+-N)與硝態氮(NO3－-N)的施用均能增加土壤N2O排放，且NH4+-N比NO3－-N對N2O排放的促進作用更強[30]；而其他研究表明，NO－-N對NO排放的促進作用更顯著[31]。李明等[32]32的研究指出K+、Cl－等離子的添加會影響土壤細菌群落多樣性；其他研究表明不同含氯化合物的添加對土壤N2O的排放有不同的效應，KCl的添加對N2O排放有促進作用，而MgCl2的添加減少了N2O的排放[33]。然而，K+、Cl-等無機鹽離子對N2O排放影響機理的研究尚有不足之處。鑒于以上研究現狀與不足，本研究以毛竹林土壤為研究對象，開展室內培養試驗并結合熒光定量PCR技術，測定土壤理化性質、硝化與反硝化微生物功能基因豐度，綜合分析不同形態氮及對應陰/陽離子對毛竹林土壤N2O排放的影響，以期了解亞熱帶毛竹人工林土壤N2O排放過程對大氣氮沉降的響應機理，并為提高亞熱帶人工林氮素利用率、減緩土壤N2O排放提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區位于浙江省湖州市安吉縣天荒坪鎮毛竹林 (30°49'～30°29'N，119°64'～119°38'E)，屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫16.1oC，年均降水量1423.4 mm，無霜期230天(氣候統計值1981—2010年)[34]。該樣地為粗放經營型毛竹林，林下植被主要有山橿(Lindera reflexa)、絡石 (Trachelospermum jasminoides)、紫金牛(Ardisia japonica)、菝葜(Smilax china)、寒莓(Rubus buergeri)、山莓(Rubus corchorifolius)、百步(Stemona japonica)、金星蕨 (Parathelypteris glanduligera)、淡竹葉(Lophatherum gracile)、黑足鱗毛蕨(Dryopteris fuscipes)等。土壤類型為花崗巖發育的紅壤土類，0—20 cm表層土壤有機碳為24.31 g/kg、全氮為2.12 g/kg、全磷為0.54 g/kg、全鉀為22.59 g/kg、pH為5.34。

于2020年7月，在“浙江農林大學毛竹林林冠氮沉降研究試驗基地”，五點取樣法用土鉆取毛竹林地0—10 cm的表層新鮮土壤，帶回實驗室，除去新鮮土樣中的石頭、根系、植物殘體等雜物，過2 mm篩后，分成3份，1份自然風干用于土壤基礎理化性質的測定；1份置于-80oC冰箱中保存，用于提取DNA測定土壤微生物性質；1份置于4oC冰箱備用(采集土樣后3日內進行培養試驗)。

1.2 培養試驗

設置對照(CK)，3個氮添加處理硝酸鉀(KNO3)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4Cl)以及氯化鉀(KCl)共5個處理，氮添加處理的施氮量為每kg土施N 41.7 mg (基于N 50 kg/hm2換算所得)，相應的KCl則根據氮添加摩爾質量轉換后添加，即每kg土添加2.98 μmol。其中，NH4NO3處理中為更好的與其他處理單獨比較，其NH4+-N和NO3--N添加量均為 2.98 μmol/kg，氮添加總量為 5.96 μmol/kg。具體操作如下：稱取相當于20 g烘干土的新鮮土樣置于250 mL培養瓶中，用移液管均勻滴入1 mL各處理溶液，其中CK處理僅添加等量的去離子水。隨后將各處理的土壤含水量調節至60%田間持水量，封上保鮮膜，扎孔以保證通氣，置于25oC黑暗條件下培養(8個培養天數×5個處理×6個重復)。每次采樣前去除培養瓶保鮮膜，置于室內30 min進行氣體置換，換氣完成后用橡膠塞密封培養瓶，立即抽取20 mL培養瓶內氣體作為第一次采氣樣品，于25oC密封培養4 h，抽取20 mL培養瓶內氣體作為第二次采氣樣品，兩次氣體樣品均用氣相色譜儀(Agilent 7890B)測定N2O氣體濃度，隨后在同一培養瓶內破壞性取樣測定銨態氮和硝態氮。另外3個培養瓶同時破壞性取土(共計8個培養天數×5個處理×6個重復，每個培養天數的培養瓶均需破壞性取樣)，一部分用于測定可溶性有機碳(DOC)、水溶性氮(WSN)、pH，另一部分用于測定土壤AOA、AOB、nirK、nirS、nosZⅠ、nosZⅡ基因豐度，由于N2O排放高峰時的微生物活性通常較高，且微生物功能基因豐度與N2O排放峰值常呈現出較高的相關性，本研究中僅測定了N2O排放高峰期微生物的功能基因豐度。

1.3 土壤理化性質測定

在測NH4+-N、NO3--N培養瓶內加入KCl溶液(2 mol/L)，按5∶1液土比浸提1 h，浸提過后在170 r/min、25oC條件下充分震蕩30 min后過濾，過濾后得到的浸提液采用靛酚藍比色法測定NH4+-N含量，用雙波長差法測定NO3--N含量[35]。土壤pH用煮沸的去離子水浸提(水土比2.5∶1)，于磁力攪拌機上攪拌30 s后靜置30 min，上清液用METTLER TOLEDO?Seven Compact型 pH 計 (METTLER TOLEDO, USA)測定。對于DOC、WSN，則稱取5 g培養后的鮮土加入25 mL去離子水(水土比5∶1)，170 r/min震蕩30 min后，在20oC條件下以3500 r/min的速度離心20 min，離心后過0.45 μm濾膜，用TOC儀器(Multi C/N 3100, Germany)測定。

1.4 氮轉化相關功能基因豐度測定

DNA提取：采用試劑盒(MP Biomedicals, LLC)進行土壤微生物基因組DNA提取，具體步驟嚴格按照試劑盒的操作說明完成。提取所得土壤DNA樣品一部分采用NanoDrop2000 (NanoDrop One, USA)測定DNA濃度和純度，另一部分-20℃低溫保存待用。

標準曲線制作：通過預試驗，將提取測序正確的質粒標準品從103～108倍進行10倍稀釋，每個梯度取1 μL做模板建立標準曲線。

定量PCR檢測：擴增反應體系總體積為20 μL，包括SYBR green PCR Master Mi 10 μL，上下游引物各 0.2 μL，DNA 模板 1 μL (1～10 ng)，滅菌超純水8.6 μL[36]。將加好樣品的96-PCR板置于熒光定量PCR儀進行擴增反應，每個樣品3個重復。土壤AOB、AOA、nirS、nirK、nosZⅠ、nosZⅡ定量擴增引物序列、片段長度及熒光定量PCR條件見表1。

表1 熒光定量PCR擴增引物Table 1 Fluorescent quantitation PCR amplification primers

1.5 數據計算與分析

式中，F為排放速率，μg/(kg·h)； ρ為N2O-N密度，1.25 kg/m3；V為培養瓶中氣體的有效空間，m3；W為置于培養瓶內的烘干土重，kg；ΔC為兩次采樣時間間隔的氣體濃度差；Δt為兩次采樣的時間間隔；T為培養時的溫度，oC。

式中，M表示N2O累積排放量，μg/kg；F表示N2O排放速率， μg/(kg·h)；(Fi+Fi+1)表示同一采樣點連續兩次氣體排放速率之和；i表示第i次采集氣體樣品；(ti+1-ti)為連續兩次采集樣品期間所隔天數。

理化指標變化量公式：

用Microsoft Excel 2019軟件進行試驗數據的處理與計算，采用SPSS 18中ANONA單因素方差分析評估不同處理對土壤NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN、N2O排放速率的影響，利用Duncan法檢驗分析不同處理均值之間的差異顯著性。利用線性回歸分析方法評估氮轉化相關功能基因豐度與N2O排放速率之間的關系。此外，利用Spearman等級相關分析方法分析N2O排放速率與NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN之間，N2O累積排放量與土壤NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN、 ΔNH4+-N、ΔNO3--N、 ΔDOC、 ΔWSN之間的相關性，所有統計顯著性水平設置為P=0.05，最后用Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 土壤N2O排放

除了KCl處理外，KNO3、NH4NO3、NH4Cl處理和CK處理N2O的排放速率均在培養后的第14天出現一個峰值，以NH4NO3處理的排放速率最高，其次是 KNO3與 NH4Cl處理 (圖1a)。至培養結束 (第60天)，CK、KNO3、NH4NO3、NH4Cl和 KCl處理N2O累積排放量分別為0.31、1.91、2.67、2.30和0.60 mg/kg (圖1b)，KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl處理累積排放量的增幅分別為524.3%、771.1%、652.7%、98.6%，不同處理間排放量差異顯著(P<0.05)。培養前 14 天 CK、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、KCl處理之間N2O累積排放量存在顯著差異(P<0.05)，分別為 0.12、0.56、0.71、0.32 和 0.06 mg/kg (圖1c)，培養中后期NH4Cl處理的累積排放量顯著高于KNO3處理。

圖1 不同處理對N2O排放速率與累積排放量的影響Fig. 1 Effects of different treatments on N2O emission rate and emission amount

2.2 土壤理化性質

NH4NO3、NH4Cl處理 NH4+-N濃度在培養期間持續下降，在整個培養期間均值分別為24.19、24.15 mg/kg，與第0天相比，到培養60天時分別降低了91.01%、92.04%，ΔNH4+-N60分別為29.83、31.04 mg/kg；而KNO3處理NH4+-N濃度一直處于較低水平，其均值為1.86 mg/kg，KCl處理在培養結束時NH4+-N濃度增加了2.02 mg/kg(圖2a)。土壤NO3--N濃度的變化在氮添加處理和KCl添加處理之間差異較大。含NO3--N的NH4NO3、KNO3處理NO3--N濃度增長較多，ΔNO3--N60分別為51.06、12.12 mg/kg，NH4Cl處理在培養第28天出現峰值，但培養前后NO3--N濃度無顯著變化，KCl處理培養到60天時NO3--N濃度增長了3.22 mg/kg (圖2b)。

圖2 培養過程中土壤NH4+-N、NO3--N濃度的變化Fig. 2 Variation of soil NH4+-N and NO3--N concentrations during incubation

與第0天相比，培養第60天時氮添加處理與KCl添加處理均增加了土壤可溶性有機碳含量，但氮添加處理與KCl添加處理間無顯著差異(圖3a)。NH4NO3、NH4Cl、KNO3、KCl處理之間水溶性氮(WSN)含量存在顯著差異(P<0.05)，培養期間均值分別為38.85、13.51、29.75、2.88 mg/kg。在培養60天時NH4NO3、NH4Cl處理WSN含量增長較多，NH4NO3、NH4Cl、KNO3處理 ΔWSN60分別為 12.78、16.13、2.41 mg/kg (圖3b)。

圖3 不同處理對土壤可溶性有機碳與水溶性氮含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on soil soluble organic carbon and nitrogen contents

與CK處理相比，KNO3、NH4NO3、NH4Cl及KCl處理均顯著降低了土壤pH (圖4)。各處理與培養第1天相比，KNO3處理在培養前28天pH降幅與KCl無差異，但在培養第60天時，pH顯著低于KCl處理；NH4NO3、NH4Cl處理pH在培養28天時已顯著低于CK和KCl處理，至培養結束時，分別比培養第1天時顯著降低了0.25、0.22 (圖4)。在培養前期 (14 天)，KNO3、NH4NO3、NH4Cl和 KCl處理間pH無顯著差異，在培養第28、60天，有K+存在的KNO3、KCl處理的土壤pH均顯著高于有NH4+存在的NH4NO3、NH4Cl處理(P<0.05)，表明是NH4+降低了土壤pH，K+、Cl－和NO3-對土壤pH的影響較小 (圖4)。

圖4 不同處理對土壤pH的影響Fig. 4 Effects of different treatments on soil pH

2.3 土壤氮循環相關功能基因豐度

在培養第14天時，測定了與土壤硝化和反硝化作用相關的功能基因豐度(圖5)。CK處理的AOA基因豐度顯著低于KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl處理，但這4個處理之間無顯著差異(P>0.05)。NH4NO3和NH4Cl處理的AOB基因豐度顯著高于KCl處理，且KCl、NH4NO3、NH4Cl三者顯著高于CK和KNO3處理，但CK和KNO3處理之間無顯著差異(P>0.05)。

圖5 不同處理土壤氮轉化相關功能基因豐度Fig. 5 Abundance of functional genes related to soil nitrogen transformation under different treatments

無機氮和KCl添加處理的nirK基因豐度均高于CK，NH4NO3處理nirK基因豐度最高，且與其他處理有顯著差異(P<0.05)，而nirS基因豐度在KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl添加處理間無顯著差異(P>0.05)。土壤中nosZⅠ基因豐度較nosZⅡ略高，但兩者的豐度變化趨勢相似，外源氮和KCl添加處理的nosZⅠ、nosZⅡ基因豐度均低于CK處理，NH4Cl與KNO3處理間存在顯著差異(P<0.05)，而NH4NO3與NH4Cl、KNO3處理間無顯著差異(P>0.05)。

2.4 土壤N2O排放與各測定因子的相關關系

整個培養期間(0—60天)的N2O排放速率與NO3--N、WSN呈顯著正相關，與pH呈顯著負相關(P<0.05) (表2)。N2O峰值排放速率(培養第14天)與NO3--N、NH4+-N、WSN以及nirK豐度呈顯著正相關(P<0.05)，與pH、nosZⅠ、nosZⅡ顯著負相關(P<0.05，表2，圖6)。培養前14天的N2O累積排放量僅與 ΔNO3--N呈極顯著相關(P<0.01，表3)。而在培養后期(14—16天)及整個培養期(0—60天)的N2O累積排放量與 ΔNH4+-N、ΔNO3--N及 ΔWSN均呈顯著相關(P<0.05，表3)。

表2 N2O排放速率與土壤NO3－-N、NH4+-N、可溶性有機碳 (DOC) 、水溶性氮(WSN) 及pH的相關性(r)Table 2 Correlation between N2O emission rate and contents of soil NO3－-N, NH4+-N, dissoved organic carbon (DOC),water soluble nitrogen (WSN) and pH

圖6 土壤氮轉化相關功能基因AOA、AOB、nirK、nirS、nosZⅠ、nosZⅡ豐度與N2O峰值排放速率相關性分析Fig. 6 Relationships between the abundance of functional genes AOA, AOB, nirK, nirS, nosZⅠ, and nosZⅡrelated to soil N transformation and peak N2O emission rate

表3 土壤NO3－-N、NH4+-N、可溶性有機碳 (DOC) 、水溶性氮(WSN)變化量與N2O累積排放量的相關性(r)Table 3 Correlation between changes of soil NO3－-N,NH4+-N, dissoved organic carbon(DOC), water soluble nitrogen (WSN) and cumulative N2O emission

3 討論

3.1 氮形態對土壤N2O排放的影響

添加NH4Cl與KNO3均顯著提高了毛竹林土壤N2O排放，且前者的促進作用更為顯著。本研究結果與王磊等[42]的研究一致，他們認為NH4+在轉化為NO3-的硝化過程中也能產生N2O，即NH4+-N可通過硝化、反硝化兩個過程生成N2O，較等量的NO3--N僅經反硝化一個過程生成N2O的效率更高，故而NH4Cl添加的土壤N2O排放量較KNO3處理更高。然而與本研究結果相反，Zhou等[43]發現NO3--N添加對N2O的排放有更強的促進作用[44]，這可能是過量的NH4+-N會抑制氨氧化細菌的活性。本研究中，NH4Cl處理的土壤NH4+-N含量顯著高于KNO3處理，土壤AOA、AOB豐度也較高，且ΔNH4+-N與N2O累積排放量顯著相關(P<0.05)。有研究發現，AOA和AOB所攜帶amoA基因，會將NH3氧化生成羥胺(NH2OH)，NH2OH會在細胞色素P460作用下以NO為中間體轉化為N2O，另外在硝化過程中NH2OH也會因化學分解而釋放出N2O[45-46]，而NH4+-N積累會刺激土壤AOA、AOB的增長。另外，NH4Cl處理水溶性N (WSN)在培養28天后增加，WSN礦化所產生的NH3可能會刺激AOB和AOA生長。由此表明，NH4Cl添加可以通過增加硝化作用的底物和氨氧化微生物數量來促進土壤硝化作用，從而促進N2O的產生[47]。由此可知，硝化過程排放的N2O增多可能是造成NH4Cl處理土壤N2O排放量高于KNO3處理的原因之一。

KNO3處理土壤中的NO3--N含量顯著高于NH4Cl處理，且其nirK基因豐度在數值上也相對高于NH4Cl處理，但與NH4Cl處理無顯著差異。NO3--N與nirK作為反硝化作用的底物與功能基因，培養前期NO3--N、nirK的增加會促進土壤反硝化作用，進而增加N2O的排放[48]。本研究還發現，N2O排放速率與NO3-、nirK豐度顯著正相關，并且ΔNO3--N不論在培養峰值前期還是整個培養過程均與N2O累積排放量顯著相關(P<0.05)。由此，本研究認為以NO3--N為底物的反硝化過程所產生的N2O是導致KNO3培養前期N2O累積排放量高于NH4Cl處理的另一重要原因。驅動反硝化過程的微生物屬于異養微生物，反硝化作用的順利進行需要充足的有機碳，Dandie等[49]的研究表明，有效碳的增加會使反硝化菌的數量增加。KNO3、NH4Cl處理直接或間接為反硝化作用提供了充足的底物，且培養結束時均提高了可溶性有機碳(DOC)的含量，底物與有效碳的增加綜合作用，刺激nirK型反硝化微生物增長，促進NO2-被還原為NO，間接刺激反硝化過程造成N2O排放增加[50]。然而在培養中后期(14—60天)，KNO3處理N2O累積排放量顯著低于NH4Cl處理，這可能是由于NH4Cl處理后期將礦質氮經硝化反硝化作用轉化為N2O的同時導致土壤酸化而造成的結果[51]。本研究發現培養中后期N2O累積排放量與礦質氮變化量顯著相關，而N2O排放速率與pH、nosZⅠ、nosZⅡ顯著負相關。NH4Cl添加處理培養后期，土壤中的pH顯著低于KNO3處理，且較CK處理有所降低，土壤pH的降低會減弱NH3的有效性從而抑制自養硝化[52]，同時較低的土壤pH可能通過NO2-的化學反硝化作用抑制N2O還原酶活性[53]，降低反硝化功能基因nosZⅠ、nosZⅡ豐度，減弱N2O還原為N2過程，進而提高了N2O排放量。因此NH4Cl處理在培養后期N2O累積排放量高于KNO3處理，有可能是由于土壤酸化而導致N2O還原為N2這一過程減弱而引起的。

NH4NO3處理作為NH4+-N與NO3--N的混合氮對N2O的排放有協同作用，N2O累積排放量分別是KNO3處理與NH4Cl處理的1.40和1.16倍，這一結果與北京林業大學實驗林場的研究結果[54]相近。在本研究中，與NH4Cl處理相比，NH4NO3由于NH4+-N、NO3--N的同時添加，在培養結束后所累積的礦質氮含量更高，為微生物硝化、反硝化作用提供更充足的原料，進而促進土壤N2O排放[55]。而與KNO3處理相比，NH4NO3處理N2O排放更高的原因與NH4Cl處理相似，但NH4NO3處理比KNO3處理添加了更多的NH4+-N。再者，需要指出的是，雖然NH4NO3、NH4Cl處理中所增加的NH4+-N容易被固定在黏土礦物的晶格中而成為“固定態銨”，不能被微生物直接利用[56-57]，但大量的NH4+添加如果超出土壤NH4+的固持量，剩余的NH4+-N會被硝化細菌利用轉化為NO3--N以及中間產物N2O[42]。綜合這些原因可能造成了KNO3處理在培養后期，N2O累積排放量低于NH4NO3、NH4Cl處理。

3.2 陰陽離子對土壤N2O排放的影響

KCl處理在培養前期N2O累積排放量低于CK處理，可能是因為Cl-的添加降低了亞硝化細菌數量[58-59]。但在培養結束時(第60天)，KCl處理的N2O累積排放量是CK處理的2倍左右，這可能與氯離子添加導致土壤pH降低(圖4)而抑制了反硝化過程中的N2O還原酶活性有關，從而增加了N2O的排放。

K+的添加也有可能促進N2O的排放。由于K+與NH4+的離子半徑接近，K+同樣能被2:1型黏粒礦物所固定，從而易置換出土壤中的NH4+[60]。有研究表明，當K+與NH4+共存時，土壤固K+與NH4+量，在多數情況下，先施離子固定量大，即存在“先入為主”的現象[61]。本研究中KCl處理的添加使得K+率先進入土壤中，K+置換出了土壤中原有的NH4+，增加了土壤中礦質氮的含量，導致KCl處理在培養結束時NH4+含量增加了2.02 mg/kg，NO3-含量增加了3.22 mg/kg，從而促進硝化作用，進而增加了反硝化作用的底物(NO3-)，使反硝化作用增強，N2O排放量增加。近期，亦有研究證明K+的添加能增強異養反硝化作用[62]。K+、Cl-共同作用使KCl處理增加了土壤NH4+含量以及AOA、AOB、nirK基因豐度，但降低了nosZⅠ、nosZⅡ的基因豐度，即加強了硝化作用和反硝化作用中亞硝酸鹽還原為N2O的過程，然而降低了N2O還原至N2的過程，因此提高了N2O的排放量。

4 結論

KNO3、NH4NO3、NH4Cl添加均增加了毛竹林土壤N2O累積排放量，單施NH4+-N的促進作用顯著高于NO3--N，NH4NO3添加對N2O排放的促進作用更強。NH4+-N施入土壤后，可提高土壤中AOA、AOB、nirK豐度，同步增加硝化和反硝化作用，其還可以顯著降低土壤pH，進而抑制nosZⅠ、nosZⅡ豐度，弱化N2O還原作用，因此，銨態氮增加N2O排放的效果較強。K+、Cl-對土壤N2O排放的影響是間接的，而且對N2O排放的促進作用較弱。因此，在毛竹林生態系統中應盡量減少銨態氮的施用，以減少N2O的排放。