鱟血蛋白水凝膠的制備與表征*

梁芷珊，康信煌，吳育廉，張國光，何蘭珍，鄧春梅

(廣東海洋大學，化學與環境學院，廣東 湛江 524088)

骨骼在意外跌倒、車禍和運動創傷中經常會引起扭傷、折斷，甚至破碎等問題。在骨骼受到損壞時，目前最為常用的臨床醫療手段就是自骨移植、異骨移植和用金屬材料進行替換[1]。這些臨床治療方法無一例外都給患者帶來手術的痛苦和風險。因此，研發一種安全、有效，以及能減輕患者痛苦的骨骼醫治方法具有很大的前景。本文利用肽促進傷口愈合、促進軟骨細胞和成骨細胞增殖的特性，以期在輕微骨折時可注射含鱟血水解肽的溫敏性水凝膠[2]，從而加快軟骨組織和骨骼的自我恢復。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

馬弗爐、低溫高速離心機、冷凍干燥機、紫外分光光度計、恒溫磁力攪拌器、掃描電鏡、熱重分析儀。

殼聚糖、β-甘油磷酸鈉、醋酸、鱟血水解蛋白、胰蛋白酶、考馬斯亮藍G250、氯化鉀、氯化鈉、三水合磷酸氫二鉀、氯化鈣、六水合氯化鎂、磷酸氫二銨。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖/牡蠣殼羥基磷灰石水凝膠的制備

根據專利,制得殼聚糖牡蠣殼羥基磷灰石溫敏性水凝膠[3]。

1.2.2 鱟血水解蛋白的制備

根據專利，得到鱟血水解蛋白[4]，再制得實驗所用的0.2%的鱟血水解蛋白溶液。

1.2.3 水凝膠最適含肽量的測定

取5個干燥小燒杯，分別放入 10 mL 上述的殼聚糖/牡蠣殼羥基磷灰石水凝膠溶液，置于 30 ℃ 恒溫磁力攪拌器中攪拌,分別加入0.2%鱟血水解蛋白肽 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,通過記錄水凝膠在 37 ℃ 恒溫下的凝膠時間來表征水凝膠的好壞。

1.2.4 鱟血水解蛋白的體外釋放率

根據考馬斯亮藍法，測定水解蛋白的釋放率。取制備好的水凝膠一小塊，放入透析袋中，再置于 10 mL pH=7.4的PBS中浸泡，并在磁力恒溫水浴中 37 ℃ 恒溫攪拌。在0、1、2、4、8、12、24 h 時各取出 1 mL 浸泡液，同時加入等量的PBS溶液。通過紫外分光光度計測各個時間點浸泡液的A595,計算水凝膠的鱟血蛋白累計釋放率，并繪制蛋白釋放曲線。計算公式為[5-6]：

累計釋放率=[CnV1+(∑Cn-1)×V2]/m

(1)

式中：V1為PBS總體積；V2為PBS置換體積；Cn為第n次置換PBS后溶液中的蛋白質量濃度；m為水凝膠中含有鱟血蛋白的質量。

1.2.5 水凝膠的吸水度

將1.2.3制得的水凝膠，放入冰箱中冷凍 12 h，再將其冷凍干燥。取一定量的干燥水凝膠，稱重為W0，置于裝有蒸餾水的燒杯中。等待水分吸收充分后，將其取出，并用吸水紙吸干其表面水分，稱重為Wt,計算吸水度(R)[7-10]。

(2)

1.2.6 水凝膠的體外降解度測定

分別取 0.112 g KCl、3.998 g NaCl、0.177 g NaHCO3、0.036 g Na2SO3、0.278 g CaCl2、0.114 g 三水合磷酸氫二鉀、0.153 g 六水合氯化鎂，置于燒杯中，加入適量去離子水，并將其攪拌均勻，待完全溶解后用 500 mL 容量瓶定容，并調pH至7.4，得到人體模擬液[10-11]。將8組在 37 ℃ 下凝膠的水凝膠分別置于人體模擬液中，并定時更換溶液，在0、1、2、4、8、12、24 h 時，分別測量水凝膠質量，其降解率[12]為：

(3)

式中：W0為水凝膠的初始質量，Wt為水凝膠降解后的質量。

1.2.7 電鏡掃描

將1.2.6在人體模擬液中浸泡0、2、8、24 h 的水凝膠放進冰箱冷凍，待其結成冰后放進冷凍干燥機中冷凍干燥，將干燥的4組樣品進行電鏡掃描，在噴金 200 s,15 kV 加速電壓條件下對4組水凝膠樣品進行表面觀察[12]。

1.2.8 熱重分析

將無羥基磷灰石無鱟血水解蛋白，無羥基磷灰石有鱟血水解蛋白，有羥基磷灰石無鱟血水解蛋白，有羥基磷灰石有鱟血水解蛋白4組水凝膠進行熱重(TG)和差熱熱重(DTG)分析，條件為氮氣載氣流量為 20 mL/min，升溫速率 20 ℃，溫度為常溫到 600 ℃[13,15]。

2 結果與分析

2.1 水凝膠最適水解蛋白含量

不同水凝膠的凝膠時間見表1所示。

表1 不同水凝膠的凝膠時間

水凝膠體內凝膠的時間不宜過長，也不宜過短，因此最適含肽量為 0.6 mL,即每 10.6 mL 的水凝膠含肽量為 1.2 mg。制得的鱟血蛋白水凝膠如圖1所示。

圖1 含鱟血蛋白水凝膠

2.2 鱟血水解蛋白釋放率

紫外分光光度計測各個時間點浸泡液的A595,計算水凝膠的鱟血蛋白累計釋放率，并繪制蛋白釋放曲線，如圖2所示。通過計算，24 h 內水凝膠中的鱟血水解蛋白的累計釋放率達71.44%.

圖2 水凝膠中鱟血水解蛋白累積釋放率曲線(24 h內)

2.3 水凝膠的吸水率

3組水凝膠的吸水率和平均吸水率如表2所示。

表2 不同水凝膠的吸水率和平均吸水率

由此得出，鱟血水解蛋白水凝膠具有良好的吸水性。

2.4 鱟血水解蛋白水凝膠的體外降解度

8組水凝膠的平均質量變化如圖3所示。

圖3 水凝膠24 h質量變化曲線

由圖3可見，將水凝膠置于人體模擬液中，0～3 h 質量變化速率最大，在3～8 h 中質量變化較緩和一些，在8～24 h 中質量變化速度較快。最后測得8組水凝膠的平均降解率為50.04%。

2.5 掃描電鏡

對4組鱟血水解蛋白水凝膠進行電鏡掃描可見：沒有在人體模擬液中浸泡過的水凝膠，表面空隙結構比較緊密，網孔數目較少；在400×電鏡下孔徑與其他3組的實質孔徑大小一致，區別在于其表面沒有被降解，表面結構緊密(圖4)。在人體模擬液中浸泡 2 h 的水凝膠，表層被降解后，可看見水凝膠內部較為疏松的三維網絡結構，網孔數目多，網孔完整(圖5)。在人體模擬液浸泡 8 h 后的水凝膠，可看到表層被降解為一層透明的薄膜，表面網孔變大(圖6)。在人體模擬液浸泡 24 h 后的水凝膠，可明顯看見網孔被降解變大，表面變成網狀細絲(圖7)。

圖4 0 h水凝膠在100×和400×下的表面SEM圖

圖5 2 h水凝膠在100×和400×下的表面SEM圖

圖6 8 h水凝膠在100×和400×下的表面SEM圖

圖7 24 h水凝膠在100×和400×下的表面SEM圖

2.6 熱重分析

由圖8中TG曲線可見，水凝膠的總質量損失率為51.42%。殼聚糖水凝膠DTG曲線顯示，分解分為三個階段[3]，第一階段的分解出現在 92.73 ℃ 左右，這個階段主要是脫去水凝膠中的水分；第二階段分解發生在 194.73 ℃ 附近，殼聚糖結構單元間的糖苷鍵開始斷裂；第三階段發生在 271.23 ℃ 左右，殼聚糖的主鏈斷裂，水凝膠開始氧化、分解、炭化。從DSC曲線看到，在 105.23 ℃ 處出現吸熱峰，吸熱過后是一個放熱過程。

圖8 無羥基磷灰石無鱟血水解蛋白的殼聚糖水凝膠的TG-DTG曲線和DSC曲線

無羥基磷灰石、有鱟血水解蛋白的殼聚糖水凝膠TG-DTG曲線和DSC曲線如圖9。

圖9 無羥基磷灰石有鱟血水解蛋白的殼聚糖水凝膠的TG-DTG曲線和DSC曲線

從圖9中TG曲線可知，水凝膠的總質量損失率為45.02%。與無鱟血水解蛋白的水凝膠相比，鱟血水解蛋白能降低殼聚糖的熱損失率，能有效提高水凝膠的熱穩定性。鱟血水解蛋白對水凝膠的第一階段分解的起始溫度影響較大(第一階段的分解溫度降低至 79.05 ℃ 左右，第二階段分解發生在 183.55 ℃，第三階段分解在 276.55 ℃ 附近)。水凝膠在 87.55 ℃，出現吸熱峰，與無鱟血水解蛋白水凝膠低了 17.68 ℃。

由圖10可知：羥基磷灰石無鱟血水解蛋白的水凝膠的TG曲線顯示，該水凝膠的總質量損失率為54.21%。DTG曲線顯示，羥基磷灰石提高了水凝膠第一段的分解溫度，即第一階段出現在90～130 ℃ 附近，且在 106.58 ℃ 時達到分解最大速率。與無羥基磷灰石的水凝膠相比，分解的最大速率從第三階段變為第一階段，第二階段分解發生在 193.08 ℃ 附近，第三階段發生在 274.08 ℃ 左右。從DSC曲線中看出，有羥基磷灰石，無鱟血水解蛋白的水凝膠在 117.58 ℃ 處出現吸熱峰。

圖10 有羥基磷灰石無鱟血水解蛋白水凝膠的TG-DTG曲線和DSC曲線

圖11中TG-DTG曲線顯示，水凝膠的總質量損失率為54.01%；有羥基磷灰石和鱟血水解蛋白的水凝膠第一階段的分解同樣出現在90～120 ℃ 附近，100.31 ℃ 時有最大分解速率，在 276.39 ℃ 時發生第二階段分解，第三階段的氧化炭化分解在 276.39 ℃，較無鱟血水解蛋白的水凝膠的溫度稍微提升，說明鱟血水解蛋白的抗氧化作用在水凝膠中有顯現，一定程度上提高了水凝膠的熱穩定性。從DSC曲線可見，水凝膠在 116.82 ℃ 出現吸熱峰。

圖 １１ 有 羥 基 磷 灰 石 有 鱟 血 水 解 蛋 白 水 凝 膠 的 ＴＧ － ＤＴＧ 曲 線 和 ＤＳＣ 曲 線

3 結論

鱟血蛋白水凝膠具有良好的外觀形態;殼聚糖是較好的藥物載體，能夠將骨修復的羥基磷灰石和鱟血水解蛋白釋放到骨骼損傷處，蛋白釋放率較高；同時鱟血水解蛋白水凝膠具備較好的吸水性和降解能力。羥基磷灰石能影響水凝膠第一階段的分解溫度，水解蛋白能提高水凝膠第三階段分解的溫度，降低水凝膠的總質量損失率，提高水凝膠的熱穩定性。