改進的QuEChERS法結合液相色譜-高分辨質譜篩查熱帶水果中33種新煙堿類殺蟲劑及殺菌劑

門 雪，吳興強，仝凱旋，謝瑜杰，李 備，李建勛，魏 靜，王永麗，范春林，陳 輝*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院 國家市場監管重點實驗室（食品質量與安全），北京 100176；2.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；3.海南省食品檢驗檢測中心 國家市場監管重點實驗室（熱帶果蔬質量與安全），海南 海口 570314；4.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

熱帶水果具有營養豐富、品質優良、風味獨特等特點而深受消費者的喜愛，目前已發展成為我國重要的經濟作物，種植面積和產量逐年增加［1］。其中，芒果和香蕉等大宗熱帶水果逐漸發展成為人們日常生活中必不可少的食品，蓮霧、釋迦等小眾熱帶水果也備受追捧。然而，熱帶水果種植地溫濕度高，為了保障熱帶水果的產量與品質，在生產種植過程中通常使用農藥來避免病蟲害的侵襲［2］。同時，為了延長熱帶水果的貯藏期，需要在貯藏和運輸過程中進行保鮮處理。化學保鮮劑（殺菌劑）具有成本低、見效快等優點，在農業生產和貯運中得到了廣泛應用［3］。

新煙堿類農藥在熱帶水果種植生產過程中表現出的優良生物特性使其成為廣譜殺蟲劑，但越來越多的研究表明新煙堿類化合物會對人體健康產生不利影響［4］。殺菌劑雖然有防腐保鮮的作用，但大多有不同程度的毒性及殘留，對人體健康同樣產生一定的危害，甚至出現致癌、致畸、致突變等問題［5］。為此，許多國家和組織對熱帶水果基質中的農藥殘留進行了嚴格規定，并發布了相關農藥的最大殘留限量（MRLs）。例如我國規定新煙堿類農藥在上述4 種熱帶水果中的最大殘留限量為0.02～3 mg/kg［6］，而歐盟為0.01～0.4 mg/kg［7］。面對如此低濃度的農藥最大殘留限量標準，亟需開發一種靈敏的檢測方法進而實現熱帶水果中新煙堿類殺蟲劑及殺菌劑殘留的準確測定，以確保我國熱帶水果的食用安全。

目前果蔬基質前處理方法主要有分散液液微萃取（DLLME）［8］、加速溶劑萃取（ASE）［9］、固相萃取（SPE）［10］和QuEChERS［11-12］。其中，QuEChERS 方法因試劑材料消耗量少，前處理時間短，容易操作，且符合綠色化學的需求，因此被越來越多實驗人員所接受。為了監測熱帶水果中新煙堿類殺蟲劑及殺菌劑殘留，采用靈敏、準確的分析檢測技術是必要的。當前檢測新煙堿類殺蟲劑及殺菌劑的分析方法主要有GC-MS［13］、GC-MS/MS［14］、LC-DAD［15］、LC-MS［16］、LC-MS/MS［17］等。這些色譜-質譜聯用技術已成為殘留分析領域強有力的檢測手段，其中三重四極桿質譜憑借其靈敏度和定量準確度，逐漸發展為分析檢測行業的“金標準”；但可能存在假陽性干擾、分辨率低等不足，影響數據結果的可靠性，并且無法進行溯源分析［18］。高分辨質譜（HRMS），如飛行時間質譜（TOF）由于具有精確的質量精度、優異的分辨率、杰出的定性準確度，以及全譜信息，可在不進行額外進樣的情況下進行回顧性分析，憑借上述優勢，HRMS已在食品分析領域得到了廣泛應用［19-21］。

本文的目的是建立改進的QuEChERS多殘留分析方法，并結合LC-Q-TOF MS技術實現芒果、香蕉、蓮霧和釋迦等熱帶水果中33種新煙堿類殺蟲劑及殺菌劑的快速檢測。通過優化萃取溶劑體積、萃取鹽包種類和凈化填料，最大限度地降低基質效應的影響，使農藥回收率達到最優，并對該方法開展了方法學驗證，最終成功應用于市售熱帶水果樣品的分析，為熱帶水果基質中農藥殘留的風險監測提供了數據支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6550 LC-Q-TOF MS 配有雙噴霧離子源（Agilent 1290，Agilent technologies，Santa Clara，CA）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；KDC-40 低速離心機（中國中佳科學儀器有限公司）；N-EVAP112 氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）；AH-30 全自動均質儀（中國睿科儀器有限公司）；MS204S電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

芒果、香蕉、釋迦和蓮霧均采自海南省；農藥標準品（純度≥98%，天津阿爾塔科技有限公司）；乙酸、硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純，天津福晨化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技有限公司）；甲酸、乙酸銨（質譜級，美國Honeywell 公司）；C18、PSA、GCB（天津博納艾杰爾科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q超純水機制備的Ⅰ級水。

1.2 標準溶液配制

稱取10 mg（精確至0.1 mg）標準品，分別用甲醇、乙腈或水等溶劑溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L 的標準儲備液，于-18 ℃避光保存；根據需要，移取適量標準品儲備液用相應溶劑稀釋，配制成所需濃度的標準工作液，于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

提取：稱取已勻漿樣品10 g（精確至0.01 g）置于50 mL塑料離心管中，加入1%乙酸乙腈溶液20 mL及1 顆陶瓷均質子，渦旋振蕩1 min 后，加入EN 鹽包（4 g 硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉），旋緊蓋子，機械振蕩1 min后，低速離心5 min（轉速為4 200 r/min）。

凈化：移取6 mL上清液加入到內含900 mg MgSO4、150 mg PSA、50 mg C18及15 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋1 min 后，4 200 r/min 再次離心5 min，取出樣品管并準確移取2 mL 上清液于10 mL玻璃試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加入1 mL 含內標（100 μg/L 莠去津D5）的乙腈-水（3∶2，體積比）溶液超聲復溶，渦旋30 s后過0.22 μm濾膜，供LC-Q-TOF/MS上機檢測。

1.4 LC-Q-TOF MS分析

色譜條件：ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫為40 ℃。流動相：A 相為0.1%甲酸水（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液，B 相為乙腈。梯度洗脫程序：0 ～3 min，1% ～30% B；3 ～6 min，30% ～40% B；6 ～9 min，40% B；9 ～15 min，40% ～60% B；15 ～19 min，60% ～90% B；19 ～23 min，90%B；23 ～23.01 min，90%～1%B，平衡時間為4 min。流速：0.4 mL/min，進樣體積：5 μL。

Q-TOF MS 條件：離子源：雙通路噴射流電噴霧電離（Dual AJS ESI）源，正離子掃描；掃描范圍：m/z50～1 000；采集模式：All Ions MS/MS；毛細管電壓：4 kV；霧化氣體及壓力：氮氣，0.14 MPa；鞘氣溫度及流速：375 ℃，11.0 L/min；干燥氣溫度及流速：225 ℃，12.0 L/min；碎裂電壓：145 V。All Ions MS/MS 采集模式設置為：0～0.5 min，碰撞能為0 eV；0.5 min 后，碰撞能依次設置為0、15、35 eV。33種目標化合物的色譜-質譜參數及定性、定量離子信息見表1。

表1 33種目標化合物的保留時間（tR）、定性及定量離子信息Table 1 Retention time（tR），qualitative and quantitative ion information of 33 target compounds

2 結果與討論

2.1 萃取溶劑體積的優化

萃取溶劑的選擇由目標化合物以及所測樣品的性質決定。本研究所涉及的新煙堿類殺蟲劑和殺菌劑logKow（正辛醇/水分配系數）值的范圍為-0.19～6.62，對于該類化合物的提取乙腈展現了較強的回收效果，但在提取凈化過程中，不同水果基質的pH值有很大差異，同時本研究中部分殺菌劑對堿性環境敏感，易出現回收率下降的情況，因此考慮在萃取溶液中加入乙酸，以提高堿性敏感農藥的回收率。由于乙酸乙腈溶液可提取各種極性不同的化合物，是多殘留法中最有效的有機溶劑［21-22］，因此本文選用1%乙酸乙腈作為萃取溶劑，并分別考察了不同體積（10、20、25 mL）1%乙酸乙腈對33 種目標化合物（加標水平為100 μg/kg）的萃取效率，結果顯示，檢測出的農藥數量分別為24、27 和27。當提取溶液為10 mL 時，樣品溶液中含有較高的基質背景干擾，在相同的凈化條件下會影響化合物的測定。當提取液體積為25 mL 時，化合物響應強度降低，導致檢測靈敏度下降，同時也造成原料浪費和環境污染。因此，實驗最終選擇20 mL 1%乙酸乙腈作為萃取溶劑。

2.2 萃取鹽種類的優化

在相關研究中，常常通過改變萃取鹽的種類以考察pH值對目標化合物提取效率的影響。本研究主要比較了3種萃取鹽包對目標農藥回收率的影響，以確定最優的萃取鹽種類。萃取鹽種類分別為：初始QuEChERS 方法萃取鹽包（4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉），EN 15662 萃取鹽包（4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g 檸檬酸鈉），AOAC 2007.01 萃取鹽包（6 g 無水硫酸鎂、1.5 g 乙酸鈉）［23］。結果顯示，采用上述3種萃取鹽包對目標農藥回收率在70%～120%之間的農藥數量分別為25、30、27，表明采用EN鹽包的效果略優于其他兩種方法。這是因為通過添加檸檬酸緩沖鹽能調節基質溶液pH值，使其在5.0～5.5 之間，該pH 范圍是定量萃取和保護酸、堿敏感化合物的折中方案［11］。實驗結果也證實了一些pH 敏感型農藥，如霜霉威和乙霉威（氨基甲酸酯類農藥）通過EN 緩沖鹽具有良好的性能和穩定效果。因此，本研究選擇EN 15662萃取鹽包進行后續實驗優化。

2.3 凈化劑的優化

在農藥殘留分析的凈化方法中有幾種常用的吸附劑，如PSA、C18和GCB 等。PSA 是一種弱陰離子交換吸附劑，能有效去除基質中的有機酸和糖等極性雜質。而C18是一種反相吸附材料，可去除脂類、膽固醇和親脂化合物。GCB 是具有片層結構的弱極性吸附材料，對葉綠素、類胡蘿卜素等色素和平面型結構化合物具有很強的吸附作用［23］。芒果含有豐富的有機酸、色素和糖類，是一種復雜的樣品基質。盡管樣品溶液通過鹽析和離心沉淀作用可去除大部分干擾物質，但剩余的基質組分仍可能干擾測定并污染LC-Q-TOF MS系統，因此有必要對樣品溶液進行進一步凈化。

本文使用900 mg 無水硫酸鎂去除殘留水分，并考察了3 種不同吸附材料（PSA、C18和GCB）在不同添加量下的凈化效果。根據表2中的L9（33）正交實驗表，3因素分別為PSA、C18和GCB 的添加量。通過表2 中的R值發現，這3 個因素對可回收農藥數量的重要性順序為PSA ＞C18＞GCB。對于因素C18和GCB，添加水平1（0 mg和0 mg）和水平3（100 mg和30 mg）的K值小于水平2（50 mg和15 mg）的K值，而表3中顯示因素C18和因素GCB的3個水平對結果無顯著性影響（p＞0.05）。而對于因素PSA，表2顯示，水平2的K值大于其他兩個水平的K值，這可能是由于隨著PSA用量的增加其基質效應降低，但繼續增加其用量反而造成目標農藥吸附。同時，表3 中統計學數據分析顯示因素PSA 的p值小于其他兩個因素，這表明，相比于C18和GCB，PSA 對可回收農藥數量的影響較大。因此，樣品提取液中凈化目標農藥的最佳凈化劑添加量為：PSA 為150 mg，C18為50 mg，GCB為15 mg。

表2 正交表L9（33）優化樣品凈化方法結果Table 2 Orthogonal array L9（33）results of sample clean up method

表3 正交表L（933）的實驗結果ANOVA 分析Table 3 ANOVA analysis for experimental results from L9（33）

2.4 基質效應評價

基質效應（ME）是用于研究共提取化合物對分析物信號的影響，可通過比較基質和溶劑的響應值峰面積進行計算，其公式為：ME=（基質峰面積/溶劑峰面積）×100%［24］。在開發分析方法時，采用基質匹配標準溶液是最常用的降低基質效應的手段。本實驗通過優化樣品前處理方法，成功測定了33種農藥在基質匹配溶液中的響應值及其在純溶劑中的響應值，得到基質效應。當|ME-1|＞50%時表明該基質對農藥具有強基質效應，20%＜|ME-1|≤50%為中等基質效應，|ME-1|≤20%為弱基質效應。4種熱帶水果中33種農藥的基質效應分布見圖1。

從圖1可以看出，芒果基質中只有12.1%的農藥表現為強基質效應，中等基質效應和弱基質效應農藥總計87.9%，表明本方法對芒果有較強的抗基質干擾能力。香蕉和蓮霧基質中，中等基質效應和弱基質效應的農藥之和占比均為78.8%，表明本方法同樣適用于以上兩種基質。而釋迦基質有45.5%的農藥表現為強基質效應，表明本方法對釋迦有一定的基質干擾，可以通過基質匹配校準方法最大限度地降低基質效應對目標化合物的干擾。

圖1 4種熱帶水果中33種農藥的基質效應分布Fig.1 Matrix effect distributions of 33 pesticides in four tropical fruits

2.5 方法學驗證

2.5.1 篩查限、定量下限與標準曲線根據SANTE/12682/2019 指南對篩查限和定量下限進行驗證［25］，具體定義為在一系列濃度水平上，每個濃度做20 組加標回收實驗，檢出率達到95%以上的最低濃度即為篩查限（SDL）；定量下限（LOQ）為能可靠并精確測定分析物的最低加標濃度（回收率在70%～120%范圍內，相對標準偏差（RSD）≤20%）。在最優條件下，方法學驗證結果見表4，芒果的SDL 為0.5～10 μg/kg，LOQ 為0.5～20 μg/kg，其中LOQ 小于10 μg/kg 的農藥有31種，占比93.9%，表明該方法對芒果基質中農藥殘留的檢測靈敏度高，可滿足日常篩查需求。33種目標農藥在香蕉、釋迦和蓮霧基質中的SDL和LOQ分布情況為：SDL ≤20 μg/kg，LOQ ≤50 μg/kg（釋迦中氟啶蟲胺腈和噻蟲胺為50 μg/kg）。

向驗證基質中添加10 個濃度水平（0.5～200 μg/kg）的目標分析物，通過校準曲線計算線性相關系數（r2）考察回歸線的可靠性和準確性。結果顯示，在所研究的線性范圍內所有化合物的相關系數（r2）為0.995 1 ～0.999 8，表明各分析物的線性關系良好。

2.5.2 準確度與精密度方法的準確度與精密度通過考察向芒果樣品中添加1、2、10倍LOQ 濃度水平的加標回收率實驗，同一水平進行5 次重復實驗，以確定平均回收率和RSD，實驗結果如表4 所示。3個濃度水平下，33種農藥的回收率均在70%～120%范圍內且RSD ≤20%，數據結果表明該方法的準確度與精密度令人滿意。

表4 33種農藥的篩查限、定量下限、線性范圍、回收率及相對標準偏差Table 4 SDLs，LOQs，linear ranges，recoveries and RSDs of 33 pesticides w/（μg·kg-1）

2.6 實際樣品的檢測

應用本方法對102批次熱帶水果樣品（包括芒果47批次、香蕉43批次、釋迦6批次、蓮霧6批次）進行篩查和定量檢測。芒果樣品篩查出的農藥主要為苯醚甲環唑（檢出率為59.6%）、吡唑醚菌酯（檢出率為38.3%）、噻蟲胺和吡蟲啉（檢出率分別為23.4%和10.6%）。香蕉樣品中檢出頻次最高的農藥為吡唑醚菌酯（檢出率67.4%），其次為殺蟲劑吡蟲啉（檢出率34.9%）和殺菌劑咪鮮胺（檢出率30.2%），其中檢出的2批次超標樣品均為新煙堿類農藥（吡蟲啉和噻蟲胺），超標樣品用國標方法進行復測［26］，驗證了結果的準確性。此次檢測的12批次釋迦和蓮霧樣品中目標農藥殘留含量均低于國家規定的最大殘留限量值，相對較為安全。研究結果表明，本方法適用于熱帶水果中常用新煙堿類殺蟲劑和殺菌劑的篩查與檢測。

3 結 論

本研究采用改進的QuEChERS 法結合LC-Q-TOF MS 建立了一種檢測4 種熱帶水果（芒果、香蕉、釋迦和蓮霧）中33 種農藥殘留的分析方法，并應用于實際樣品的快速篩查與檢測。本文在傳統的QuEChERS 基礎上，對萃取溶劑體積、萃取鹽包種類及凈化填料種類與用量展開了考察，并對方法進行了驗證。結果表明，本方法簡單快速、準確可靠，能有效地降低基質效應對目標化合物的干擾，適用于熱帶水果中常用新煙堿類殺蟲劑和殺菌劑的快速篩查和準確定量，對維護熱帶水果在種植、儲藏和運輸過程中的用藥安全具有重要意義。