QuEChERS技術結合高效液相色譜-串聯質譜法測定魚肉中6種替考拉寧殘留量

金 慧，趙 城，鄭光明，魏琳婷，史曉娜，林嘉薇，李麗春，單 奇，馬麗莎，尹 怡*

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院 珠江水產研究所/農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室（廣州）/廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380）

替考拉寧（Teicoplanins）是一種從游離放線菌Actinoplanes teichomyceticus 中分離出的新型糖肽類抗生素［1］。它由替考拉寧A2-1（TA2-1）、替考拉寧A2-2（TA2-2）、替考拉寧A2-3（TA2-3）、替考拉寧A2-4（TA2-4）、替考拉寧A2-5（TA2-5）、替考拉寧A3-1（TA3-1）6 種結構相似但抑菌活性不同的成分組成［2］，對革蘭氏陽性需氧菌和厭氧菌具有良好的抗菌活性［3］。1975年，第一代糖肽類抗生素阿伏霉素在英國、挪威等一些國家作為食品動物的飼料添加劑，用于疾病治療與促生長［4］，但引起了耐藥性細菌的產生與大范圍傳播［5］。隨后，另一種糖肽類抗生素——萬古霉素被用在食品動物的養殖中并加重了細菌耐藥性問題［6］，替考拉寧則是繼萬古霉素之后的新型糖肽類抗生素。在水產養殖中違規使用、甚至濫用糖肽類抗生素，均會對我國水產品出口貿易及消費者身體健康產生不利影響。為確保食品安全和人類健康，許多國家制定了糖肽類抗生素的限量標準。日本規定了食品動物中萬古霉素的限量為10 μg/kg［7］，我國2020年發布的農業農村部250公告也將萬古霉素列為水產品等食品動物中的禁用藥［8］，歐盟規定食品動物中禁止使用阿伏霉素和萬古霉素［9］，而美國規定進口動物源性食品中禁止使用替考拉寧等糖肽類抗生素［10］。Yin 等［11］在我國珠江及沿海流域的水環境中檢出痕量替考拉寧，表明水產魚類面臨潛在的安全風險。因此，需要建立一種準確高效的檢測方法用于分析魚肉中替考拉寧的殘留水平及其風險。

替考拉寧分子量大、結構復雜、組成成分多且相似，實現其在復雜基質中的高效、靈敏檢測存在困難。常見測定替考拉寧的分析方法有熒光偏振免疫分析法（FPIA）［12-13］、高效液相色譜法（HPLC）［14-15］、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）［16-18］等。其中，FPIA 法測定替考拉寧易產生假陽性結果，準確度低。HPLC法難以進行替考拉寧多組分的區分測定，且分析時間長、靈敏度低。LC-MS/MS法可通過特定的母離子和子離子實現替考拉寧多組分的準確識別及高靈敏檢測［19-20］。由于水產品中富含不飽和脂肪酸、蛋白質等復雜成分，且待測物含量低，分析常需要復雜的前處理方法凈化，操作較繁瑣耗時。QuEChERS 技術是2003 年Anastassiades 等提出的樣品前處理技術，包含了樣品的提取和凈化兩個步驟，具有簡單、快速、準確、高效等優點［21］。該技術早期在水果、蔬菜等食品基質的多農藥殘留檢測中展現了良好的分析效果［22］。近年來，QuEChERS 技術在一些復雜基質如水產品［23］、蜂蜜［24］、乳制品［25］、土壤［26］等領域均得到應用，涉及的檢測目標物包括氟蟲腈［27］、喹烯酮［28］、雌激素［29］、真菌毒素［30］等。然而在糖肽類抗生素的檢測中，QuEChERS 技術目前鮮有報道。基于此，本研究建立了QuEChERS 技術結合HPLC-MS/MS 測定魚肉中6種替考拉寧組分的分析方法，進行了方法學評價并應用于實際樣品的檢測。該方法靈敏度高、精密度好、簡單高效，可用于魚肉中替考拉寧殘留的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290 高效液相色譜和6470 三重四極桿質譜（美國Agilent 科技公司）；FP3010 料理機（德國Braun 公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Genie 15 超純水系統（中國Rephile 公司）；TDL-5-A 離心機（上海安亭公司）；IKA MS3 basic 旋渦振蕩儀（德國IKA 公司）；KQ5200E 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國Organomation公司）。

替考拉寧標準品（純度為98%，含有TA3-1，TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5，上海ZZBIO公司）；硫酸多粘菌素B（純度為91%，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，東京化成工業株式會社）；乙酸銨（分析純，阿拉丁公司）；氨水（25%）、三氯乙酸、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（分析純，麥克林公司）；氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，50 μm）、十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm）購自天津Agela 公司；石墨化炭黑（GCB）購自CNW 公司；陶瓷均質子15 mL tubes 購自美國Agilent 科技公司；0.22 μm PTFE 微孔濾膜購自天津Agela 公司；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取替考拉寧標準品和硫酸多粘菌素B（內標），用0.1%甲酸水分別溶解定容至10 mL，制得1 mg/mL 標準儲備液，于-18 ℃避光保存。用甲醇-0.1%甲酸（1∶1，體積比）分別稀釋標準貯備液制得10 μg/mL 標準工作液，于4 ℃避光保存。用甲醇-0.1%甲酸（1∶1）將替考拉寧稀釋成質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的標準工作曲線校準溶液（均含有內標30 ng/mL）。

1.3 樣品前處理

提取：準確稱取1.00 g已絞碎混勻的魚肉樣品于15 mL聚丙烯離心管中，加入30 μL 1 μg/mL 的硫酸多粘菌素B 溶液作為內標，渦旋10 s 后常溫下放置30 min。加入2.5 mL 乙腈-10%三氯乙酸溶液（6∶4）和陶瓷均質子，渦旋混勻1 min，超聲10 min，5 000 r/min 離心5 min，上清液轉移至15 mL 聚丙烯離心管；殘渣重復提取1次，合并上清液。

凈化：向上清液中加入100 mg PSA，渦旋30 s，5 000 r/min 離心5 min。上清液轉移至10 mL 玻璃離心管中，40 ℃氮吹至近干，用1 mL 0.1% 甲酸乙腈-水（4∶6）定容，過0.22 μm 微孔濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱：Agilent SB C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，流速：0.30 mL/min，進樣量：10 μL。流動相：A 為0.1%甲酸乙腈，B 為0.1%甲酸。梯度洗脫：0～0.5 min，5%B；0.5～1.0 min，5%～30%B；1.0～2.0 min，30%～40%B；2.0～3.0 min，40%～95%B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～4.0 min，5%B。

離子源：電噴霧離子源，掃描方式：正離子模式，監測模式：多反應監測模式，干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣流速：5 L/min，霧化氣壓力：0.24 MPa，鞘氣溫度：325 ℃，鞘氣流速：9 L/min，毛細管正向電壓：3 500 V，噴嘴正向電壓：500 V。6種替考拉寧組分和內標物的質譜參數見表1。

表1 多反應監測模式下6種替考拉寧的質譜參數Table 1 MS parameters of six teicoplanins in the multi-reaction monitoring mode

1.5 基質效應

基質效應（ME）通常由與分析物共萃取的基質組分引起，可以抑制或增強分析物在ESI條件下的電離響應，導致定量結果不準確。通過在流動相溶劑中配制的標準曲線的斜率與基質標準曲線的斜率進行比較，可計算出基質效應［31］，其計算公式為：ME（%）=(Bs-As)/As×100%，式中Bs表示基質匹配標準曲線的斜率，As表示溶劑標準曲線的斜率。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

將1 mg/L替考拉寧標準工作液以0.01 mL/min流速注入電噴霧離子源中，對6種替考拉寧組分的質譜參數進行優化。在正離子模式下，替考拉寧的6個組分均易帶多個電荷，如［M+H］+、［M+2H］2+和［M+3H］3+。對其靈敏度進行比較，發現替考拉寧各組分的［M+2H］2+離子具有較好的豐度值。利用選擇的母離子進一步碰撞產生子離子，每個分析物通過一個母離子和兩個子離子進行監測。通過優化碎片電壓、碰撞能等參數確定最佳定性、定量離子。通過優化鞘氣溫度、鞘氣流速等離子源參數確定最佳離子源條件。結果顯示，替考拉寧中的TA2-2 和TA2-3、TA2-4 和TA2-5 為兩對同分異構體，在定性時無法進一步分離，只能進行總量測定。硫酸多粘菌素B 與替考拉寧具有相似的化學結構，均為極性較強的化學物質，在LC-MS/MS中可以較好地分離，不對待測組分的檢測造成干擾。此外，由于水產行業內不使用硫酸多粘菌素B，因此本研究選取硫酸多粘菌素B作為內標物。

2.2 色譜條件的優化

對比了流動相分別為甲醇和乙腈的分離效果，結果發現乙腈對6種替考拉寧組分的分離效果更好。通過向流動相中加入0.1%甲酸、0.2%甲酸以及0.01 mol/L乙酸銨觀察峰形及靈敏度變化，結果顯示替考拉寧各組分在0.1%甲酸流動相中具有最佳的響應值且峰形尖銳對稱。因此，實驗采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫。在此條件下，6 種替考拉寧組分得到良好的分離和較高的靈敏度，分析物的色譜圖如圖1所示。

圖1 6種替考拉寧組分及內標物（10 ng/mL）的色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of six teicoplanin components and the internal standard substance at 10 ng/mL

2.3 提取條件的優化

替考拉寧是一種極性較強的多肽類物質［2］，根據相似相溶原則，實驗對比了甲醇、乙腈和水等溶劑對替考拉寧的提取效果。發現采用甲醇和乙腈進行提取時，提取效率較低；采用水進行提取時，提取液中雜質較多，目標物受基質影響導致靈敏度降低。基于乙腈和三氯乙酸沉淀蛋白的優勢，本研究考察了不同濃度乙腈-三氯乙酸水溶液的提取與凈化效果。結果顯示，隨著乙腈體積分數的升高，目標物的回收率上升，當乙腈體積分數為20%～60%時，目標物的回收率在75%左右，為達到好的凈化效果，實驗選擇60%乙腈水溶液進行提取（圖2A）。進一步調節三氯乙酸體積分數發現，在三氯乙酸為0%～10%時，目標物的回收率不斷上升至接近90%，三氯乙酸為10%～40%時，目標物的回收率趨于穩定并有下降趨勢。依據經濟環保原則，實驗選擇10%的三氯乙酸（圖2B），即選擇乙腈～10%三氯乙酸（6∶4，體積比）作為最佳提取溶劑。進一步考察了不同體積（2、4、5、6、8、10 mL）提取溶劑的影響，結果發現5 mL提取溶劑可實現良好的提取效果（圖2C）。

圖2 不同提取條件對6種替考拉寧組分回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction conditions on recoveries of six teicoplanin components

在QuEChERS 方法中，常采用無機鹽使有機相與水相分層，促進目標物從水相轉移到有機相中。實驗比較了不加入無機鹽，加入2.0 g 無水硫酸鈉及加入2.0 g 無水硫酸鎂時對目標物回收率的影響。發現鹽的加入降低了目標物的回收率（圖2D）。因此，實驗選擇不加無水硫酸鈉等鹽。

2.4 凈化條件的優化

在凈化過程中，吸附劑通過吸附作用減少基質干擾物的含量，從而提高目標物的回收率。實驗采用100 μg/kg的空白基質加標樣品作為對照，比較了不同吸附劑（PSA、C18和GCB）對目標物回收率的影響（圖3A）。發現使用PSA后，替考拉寧各組分的回收率約為90%；使用C18后，替考拉寧各組分的回收率低于80%；而使用GCB 后，各組分的回收率均低于60%，原因可能是其吸附含有苯環平面的物質［32］。因此，實驗選擇PSA作為最佳凈化劑。

為獲得良好的凈化效果，進一步對不同PSA 用量（25、50、75、100、150 mg）進行優化，結果如圖3B 所示。當PSA 用量增加時，替考拉寧各組分的回收率不斷上升，在100 mg時，6種替考拉寧均獲得最佳回收率，當PSA達到150 mg時，目標物的回收率明顯下降。因此，實驗選擇100 mg PSA 用于樣品凈化。

圖3 吸附劑種類（A）及用量（B）對6種替考拉寧組分回收率的影響Fig.3 Effects of adsorbent type（A）and dosage（B）on recoveries of six teicoplanin components

2.5 基質效應

由于魚肉樣品富含脂肪、蛋白質等基質，在進行LC-MS/MS 樣品分析時易引起基質效應。采用5 種空白基質（羅非魚、鯽魚、鯉魚、大黃魚和鱖魚）配制相應的基質標準曲線，與流動相配制的溶劑標準曲線進行比較，評價了6種替考拉寧組分在不同種類魚中的基質效應（ME）。當ME 為正值時表示信號增強，為負值時表示信號抑制，|ME|范圍在0～20%、20%～50%和＞50%時分別呈現弱、中、強基質效應［33］。采用本方法進行檢測，不同魚肉基質中替考拉寧組分的基質效應如圖4 所示，5 種魚肉中替考拉寧均表現出基質抑制作用，|ME|在1.16%～19.82%之間，表明基質效應較弱。

圖4 替考拉寧組分在5種魚類中的基質效應Fig.4 Matrix effects of six teicoplanin components in five fishs

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

采用“1.2”配制的質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的替考拉寧系列標準工作溶液，加入內標物（質量濃度為30 ng/mL），繪制標準曲線并做線性回歸分析，結果如表2所示。6種替考拉寧的相關系數（r2）均大于0.998，線性范圍為1～100 ng/mL 或2～100 ng/mL。在空白樣品中添加目標物，以信噪比為3和10分別計算檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），測得其LOD為0.5～2.0 μg/kg，LOQ為2.0～5.0 μg/kg。

表2 替考拉寧組分的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of six teicoplanins

2.7 回收率與相對標準偏差

采用羅非魚、鯽魚、鯉魚、大黃魚和鱖魚等5 種陰性樣品作為空白基質進行加標回收實驗。分別在5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 個濃度水平添加6 種替考拉寧，計算加標回收率和相對標準偏差（n=6），結果見表3、表4。所有分析物的加標回收率為84.3%～93.3%，日內及日間相對標準偏差分別不大于7.0%、6.2%，結果表明該方法準確度高、精密度好，能夠滿足多種魚肉的日常檢測需求。

表3 6種替考拉寧在魚肉樣品中的回收率及日內相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of intra-day of six teicoplanin in spiked fish（n=6）

表4 6種替考拉寧在魚肉樣品中的回收率及日間相對標準偏差（n=6）Table 4 Average recoveries and RSDs of inter-day of six teicoplanins in spiked fish（n=6）

2.8 實際樣品的測定

從市場購得40份魚肉樣品，包括鯽魚、鯉魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鱖魚、羅非魚、大黃魚和大菱鲆等9 個品種。采用建立的方法進行實際樣品測定，發現40 份魚肉樣品中均未檢出替考拉寧成分。選取其中3種空白魚肉樣品，按5.0 μg/kg 濃度水平添加替考拉寧混合標準溶液，按照本方法進行提取和測定，得到加標回收率為86.7%～91.2%，符合質控要求，表明該方法可用于實際樣品的分析。

3 結 論

本研究采用QuEChERS 結合高效液相色譜-串聯質譜建立了同時測定魚肉樣品中多種替考拉寧組分的檢測方法。實驗優化了質譜條件、色譜條件及QuEChERS 前處理步驟，考察了多種魚肉樣品中的基質效應并進行了方法學評價。所有分析物在各自濃度范圍內線性關系良好，檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量下限為2.0～5.0 μg/kg。目標物在多種魚肉樣品中的回收率為84.3%～93.3%，日內及日間相對標準偏差均不大于7.0%，基質效應弱。結果表明該方法簡單、高效、準確性好、靈敏度高，可用于實際魚肉樣品6種替考拉寧組分的準確定量分析。