食品加工機械材料橡膠密封墊圈中5種熒光增白劑遷移量的測定及其遷移規律研究

候德莉，徐 莉，梁振綱，戴小麗，吳毓浪

（海口海關技術中心，海南 海口 570311）

熒光增白劑（Fluorescent whitening agents，FWAs），亦稱為白色染料，是一類能夠吸收不可見紫外光，進而激發出可見藍色或藍紫色熒光的復雜有機化合物［1-3］。近年來，隨著食品安全問題日漸突出，熒光增白劑的危害以及其向食品遷移的情況逐漸引起人們的重視。橡膠是制作密封墊圈最常見的材料之一，具有較好的綜合機械性能、高度化學穩定和耐磨性等優勢，在食品加工機械材料中應用廣泛。但市場上不少商家在生產橡膠墊圈時使用劣質材料或回收材料以次充好，并通過非法添加熒光增白劑提高產品的艷度和白度，從而削減成本、增大利潤。在食品加工過程中，受接觸食品的種類、濃度、溫度以及接觸時間等因素的影響，橡膠墊圈中的熒光增白劑易滲透遷移到食品中，進而隨食物進入人體，在體內與蛋白質結合后不易分解，可在肝臟和其他重要器官蓄積從而造成器官損壞甚至致癌［4-7］。因此，世界各國對食品接觸材料中熒光增白劑的含量均有明確限制［8-11］，如我國國家標準GB 9685-2016規定FWA184和FWA393的特定遷移限量（SML）分別為0.6 mg/kg和0.05 mg/kg，歐盟法規2002/72/EC 規定FWA184 的SML 為0.6 mg/kg，美國聯邦法規則規定FWA184 的加入量不得超過0.015%等，但都缺少配套的檢測標準。

目前，熒光增白劑接觸安全性的研究主要集中在紙張［12］、塑料制品［13-14］、化妝品［15-17］和紡織品［18］等基質，相關檢測方法主要有紫外燈法［19］、分光光度法［20-21］、高效液相色譜法［22］、液相色譜-質譜聯用法［23-24］等，其中液相色譜-串聯質譜法結合了色譜對復雜樣品的高分離能力和質譜高選擇性、高靈敏度的優點，在食品分析中應用廣泛。但對食品加工機械材料橡膠密封墊圈中熒光增白劑的檢測以及遷移規律的研究鮮有報道。因此，本文選取食品加工機械材料橡膠密封墊圈為基質，以FWA184、FWA185、FWA367、FWA135、FWA393為研究對象，建立了上述5種熒光增白劑的液相色譜-串聯質譜檢測方法，并在可預見的使用情形下選擇最嚴苛的實驗條件，探索5 種熒光增白劑向橄欖油模擬物的遷移規律。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 4000 Q三重四極桿質譜儀（美國ABI公司），配有電噴霧離子源；Harvard II 針泵（美國Varian 公司）；DMV-16旋渦混勻器（廣東科寅公司）；Centrifuge 5810 R 離心機（德國Eppendorf 公司）；SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海錦屏公司）；G-285電子天平（瑞士Mettler公司）。

FWA184 標準品（純度≥99.9%，CAS：7128-64-5），FWA185 標準品（純度≥99.6%，CAS：2866-43-5），FWA393 標準品（純度≥96.6%，CAS：1533-45-5），FWA367 標準品（純度≥98.3%，CAS：5089-22-5），FWA135標準品（純度≥98.9%，CAS：1041-00-5）購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（色譜純，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜純，德國Merck 公司）、冰乙酸（分析純，美國Fisher Scientific 公司）、無水乙醇（優級純，科密歐公司）；橄欖油（化學純，麥克林公司）；三元乙丙橡膠（牌號EPDM 6470，德國Lanxess 化學公司產品）；超純水由實驗室超純水機制備；C18、PLS、AL-N、PSA、PH、GCB凈化劑（迪馬科技公司）；微孔濾膜（0.22 μm，有機系）。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液（1 mg/mL）：各稱取5種熒光增白劑標準品10 mg（精確至0.01 mg），分別用丙酮溶解并定容至10 mL，于4 ℃避光保存。

混合標準中間液（1 μg/mL）：分別吸取適量上述標準儲備液，用丙酮定容至10 mL，得到混合標準中間液。

1.3 色譜條件

色譜柱：資生堂MGⅡC18（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈，梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%～60% A；1.0～3.0 min，60%～10% A；3.0～11.0 min，10%A；11.0～12.0 min，10%～90%A；12.0～14.0 min，90%A。流速：0.6 mL/min；進樣體積：1 μL。

1.4 質譜條件

電噴霧正離子掃描（ESI+）；離子源電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；多反應監測（MRM）模式；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣。5 種熒光增白劑標準品溶液通過針泵流動注射直接進樣，一級質譜全掃描確定化合物母離子，對母離子碰撞后進行二級質譜掃描，得到碎片離子。優化后的質譜條件見表1。

表1 MRM模式下5種熒光增白劑的質譜參數Table 1 Mass parameters of 5 fluorescent whitening agents under MRM mode

1.5 實驗方法

1.5.1 樣品制備取5 種待測組分各5 g 加至1 kg 三元乙丙橡膠中，經硫化后得到特制陽性樣品（食品級）。

1.5.2 食品模擬物的選取依據GB 5009.156-2016《食品安全國家標準食品接觸材料及制品遷移試驗預處理方法通則》［25］和GB 31604.1-2015《食品安全國家標準食品接觸材料及制品遷移試驗通則》［26］要求，選取水、4%乙酸水溶液、50%乙醇水溶液、橄欖油4 種食品模擬物分別代表水基非酸性食品、水基酸性食品、酒精類食品和油基食品進行遷移試驗。

1.5.3 提取水基性和酒精性食品模擬物經遷移試驗處理后，準確稱取5.0 g（精確至0.001 g）于10 mL比色管中，以流動相定容至刻度，混勻后取1 mL至進樣瓶，待測；橄欖油食品模擬物基質復雜，對熒光增白劑附著度高，試驗準確稱取1.0 g（精確至0.001 g）橄欖油模擬物于玻璃離心管中，加入10 mL丙酮溶解，渦旋3 min，取1 mL樣液，加入50 mg C18粉末凈化，渦旋離心后，取上清液過微孔濾膜，進LC-MS/MS檢測。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于FWAs 極性小、易溶于油脂中與油深度結合，采用甲醇、甲醇水、乙腈等有機溶劑均無法將待測組分有效萃取；小極性溶劑如正己烷、乙酸乙酯與流動相不互溶，不適合作為提取溶劑。橄欖油和待測組分可有效溶解于丙酮、二氯甲烷中，本文嘗試以兩者為提取溶劑，直接將橄欖油樣品溶解后萃取。結果表明，二氯甲烷作為提取溶劑時對FWA367、FWA393、FWA184無回收，丙酮對5種FWAs均有較好的提取效果，因此采用丙酮作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

丙酮提取后的樣液直接進LC-MS/MS檢測，結果顯示FWA185、FWA184、FWA135有極強的基質增強效應。考慮到丙酮作為溶劑不適合采用反相吸附的固相萃取小柱凈化，本文通過分散固相萃取法，正相吸附提取溶劑中的基質干擾物，分別考察了PLS、Al-N、PH、C18、PSA、GCB 6種凈化劑的凈化效果。結果表明，PLS、PSA 和Al-N 對FWA367 有吸附作用，回收率低于60%；PH 無法清除FWA184的基質增強效應，回收率大于150%；使用GCB 凈化時，FWA184 回收率低于80%，其余組分回收率均低于10%；而C18作為凈化劑時，所有組分的回收率均在80%～110%范圍，故采用C18作為凈化劑。不同凈化方式在0.05 mg/kg加標水平的回收率見圖1。

圖1 不同凈化方式在0.05 mg/kg加標水平的回收率Fig.1 Recovery under different purification methods at 0.05 mg/kg spiked level

2.3 流動相選擇

分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol/L 乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸銨）溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-10 mmol/L 乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸銨）溶液6 種流動相體系對峰形和響應值的影響。結果表明，乙酸銨作為流動相會抑制FWA393 的響應，而甲酸的加入能夠促進化合物離子化，使響應值增高；乙腈-0.1%甲酸溶液體系相對甲醇-0.1%甲酸溶液體系洗脫效果好，且體系壓力低，能夠有效保護儀器和延長色譜柱使用壽命，故采用乙腈-0.1%甲酸溶液體系作為流動相。

2.4 基質效應、線性關系及定量下限

基質效應對檢測結果的準確度和精密度存在重要影響［27］，本文采用相對響應值法（基質中待測組分響應/純溶劑中待測組分響應× 100%）［28］考察5 種FWAs 在橄欖油食品模擬物中的基質效應。將3組陰性橄欖油基質在優化條件下進行提取和凈化，用凈化后的基質樣液配制50 ng/mL 的5 種FWAs 混合標準品，分別以3 組響應值結果的平均值與純溶劑配制的50 ng/mL 的5 種FWAs混合標準品的響應值進行比較評價基質效應。結果表明，經C18凈化后，5種FWAs在橄欖油食品模擬物中的相對響應值均在80%～100%范圍內，屬于弱基質效應，可直接采用溶劑配制標準曲線進行定量。

將混合標準溶液配制成5、10、20、50、80、100 ng/mL 的系列標準溶液，在優化條件下依次進樣分析，以目標化合物的質量濃度（x）為橫坐標，定量離子的峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，5種FWAs在5～100 ng/mL范圍內有良好的線性關系，相關系數r≥0.999 1。根據10倍信噪比并計入試樣量和定容體積，計算定量下限（LOQ）。得到5種FWAs在水模擬物中的定量下限為0.001～0.003 mg/kg，在3%乙酸模擬物中的定量下限為0.002～0.003 mg/kg，在50%乙醇中的定量下限為0.001～0.005 mg/kg，在橄欖油模擬物中的定量下限為0.008～0.050 mg/kg。

2.5 回收率與相對標準偏差

以空白橄欖油食品模擬物為基質，對其進行3個水平（0.05、0.1、0.5 mg/kg）10個平行的加標回收實驗，考察方法的回收率和相對標準偏差（RSD）。方法的平均回收率為81.8%～101%，RSD 為1.2%～5.6%，結果見表2。

表2 橄欖油中5種熒光增白劑的平均回收率和相對標準偏差（n=10）Table 2 Recoveries and RSDs of 5 fluorescent whitening agents in olive oil（n=10）

2.6 實際樣品檢測

應用本方法對市售4 種材質（丁腈橡膠、硅橡膠、三元乙丙橡膠、氟橡膠）橡膠密封墊圈樣品進行測定，所選樣品均標注食品級。以橄欖油模擬物為浸泡液，70 ℃條件下浸泡24 h，所得食品模擬物按照“1.5.3”方法處理后采用高效液相色譜-串聯質譜法分析。結果在丁腈橡膠材質樣品的橄欖油模擬物中檢出FWA184，遷移量為26.6 μg/L，換算為特定遷移量為0.19 mg/kg，未超過GB 9685-2016［8］規定的FWA184 特定遷移限量（SML）（0.6 mg/kg）的要求。其余3 種材質樣品的橄欖油模擬物中均未檢出5種熒光增白劑。

3 遷移規律研究

3.1 食品模擬物對遷移量的影響

按照GB 31604.1-2015 《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》［26］和GB 5009.156-2016《食品安全國家標準食品接觸材料及制品遷移試驗預處理方法通則》［25］要求，測定了特制陽性樣品中5種熒光增白劑在超純水、4%乙酸溶液、50%乙醇溶液和橄欖油模擬物中于70 ℃條件下浸泡30 h的遷移情況，每種模擬物平行測定6次，取其平均值，結果見表3。

表3 不同模擬物中熒光增白劑遷移量檢測結果Table 3 Migration of 5 fluorescent whitening agents into 4 kinds of stimulants

結果表明，5 種熒光增白劑在超純水和4%乙酸水溶液中未發生遷移；在50%乙醇水溶液中僅FWA367、FWA185 和FWA184 有 少 量 遷 移，遷 移 量 分 別 為5.22、1.04、7.21 mg/L，FWA393、FWA135未檢出；在橄欖油模擬物中，5種熒光增白劑均有不同程度遷移，遷移量遠大于其他模擬遷移物，其中，FWA184和FWA185的遷移量接近陽性樣品制備時的添加量。原因可能與5種熒光增白劑的脂溶屬性有關：本研究選取的5 種熒光增白劑均為含有苯并唑共軛體系的脂溶性化合物，更易溶于橄欖油。因此，后續影響因素的考察使用橄欖油作為食品模擬物。

3.2 溫度對遷移量的影響

選用橄欖油作為食品模擬物，浸泡時間為2 h，考察了橡膠密封墊圈中5 種熒光增白劑在5、20、40、70、100 ℃條件下的遷移量變化情況。結果見圖2。

由圖2可以看出，橡膠密封墊圈中5種熒光增白劑的遷移量隨溫度的升高而增加。在5～40 ℃條件下，遷移量處在較低濃度水平，增長趨勢接近且變化較小；當溫度高于40 ℃后，除FWA135 外，其余4 種熒光增白劑的遷移量明顯增加，且隨著溫度升高遷移量增幅變大；在100 ℃條件下，5 種熒光增白劑均快速遷出，其中FWA184 遷移量接近陽性樣品的制備添加量。這可能是由于溫度升高，材料內部分子活化能增大，高分子鏈段構象改變形成內部空間，促使小分子發生躍遷，加快了物質從材料向模擬物的遷移。

圖2 溫度對5種熒光增白劑遷移量的影響Fig.2 Effect of contact temperature on migration of 5 fluorescent whitening agents

3.3 時間對遷移量的影響

在40 ℃和70 ℃溫度條件下，考察了密封橡膠墊圈中5種熒光增白劑在橄欖油模擬物中的遷移量隨時間的變化情況，結果見圖3。由圖3 可以看出，在兩種遷移溫度下，5 種熒光增白劑的遷移量在前10 h 均快速增大，隨后遷移速率減緩直至趨于平衡，其中FWA135 和FWA393 始終處于低遷移狀態。與40 ℃相比，70 ℃下的遷移量和遷移速率增大，除FWA135 和FWA393 外，其余3 種熒光增白劑的時間釋放曲線類似。70 ℃條件下，5 種熒光增白劑達到最大遷移量的時間為24 h，40 ℃條件下達到最大遷移量時間為120 h。這可能是因為溫度升高，加劇了材料中的分子運動，使成品表層殘留的熒光增白劑更容易遷移釋放，表現為快速遷移釋放過程；而在40 ℃條件下，熒光增白劑需要充分浸泡才能通過橡膠密封墊圈材料的致密結構，表現為緩慢遷移釋放過程。

圖3 40 ℃（A）和70 ℃（B）條件下時間對熒光增白劑遷移量的影響Fig.3 Effect of time on migration of 5 fluorescent whitening agents at 40 ℃（A）and 70 ℃（B）

4 結 論

本文建立了食品加工機械材料橡膠密封墊圈中5 種FWAs 遷移量的LC-MS/MS 檢測方法。采用丙酮萃取，C18吸附凈化。結果表明，該方法快速準確、選擇性好、靈敏度高、重復性好，回收率、精確度和準確度均能夠滿足食品加工機械材料橡膠密封墊圈中5 種熒光增白劑特定遷移量的測定要求。同時，研究了模擬物、遷移溫度、遷移時間對遷移規律的影響。結果表明，5種FWAs在油基類食品模擬物中遷移能力最強，遷移量隨遷移溫度的升高不斷增加，隨遷移時間的延長呈現先快速增長隨后趨于平衡的規律。由此可見，在食品機械化加工過程中，含橡膠密封墊圈接口的管路對盛裝含油脂類的食品存在一定風險，生產企業在食品生產加工過程中應根據實際情況選擇合適的機械材料，保證消費者身體健康。