基于PI3K/Akt/NF-κB途徑探究補腎活血方治療子宮內膜異位癥的作用機制研究*

馬中嶺，劉鑫，汪玉鳳

（青海省人民醫院產科，西寧 810007）

子宮內膜異位癥（EMS）是一種臨床常見的婦科疾病，因子宮內膜組織發生轉移、侵襲，定植在宮腔以外部位造成，患者常有痛經、不孕、月經不調、盆腔包塊等癥狀，該病發病率高，影響著全球范圍內5%～10%的育齡婦女，嚴重威脅著女性身體健康和生活質量[1-2]。目前，西醫學臨床治療主要采用藥物和手術兩種療法，長期藥物療法可能加重肝腎功能損傷，而手術切除病灶后仍具有一定的復發率，臨床療效欠佳[3]。中醫認為，腎虛血瘀、腎陽不足、瘀毒阻絡是誘發EMS的主要原因，因此，對于EMS的治療，應以補腎活血、祛瘀解毒法為主，研究表明，補腎活血方（BSHXR）聯合西藥對EMS術后的療效確切，可提高治療效果，改善患者生活質量，顯著減輕患者的臨床癥狀，降低EMS的復發率，然而BSHXR對EMS的治療作用機制尚不清楚[4-5]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/核因子 κB（NF-κB）途徑是一種密切參與到細胞生長繁殖、運動、代謝和免疫應答調節的信號通路，多在惡性腫瘤疾病中呈激活狀態[6-7]。研究表明，EMS雖是良性婦科疾病，但其特點與惡性腫瘤的轉移侵襲能力相似，同樣，PI3K途徑也與子宮內膜異位癥的發病密切相關，該途徑的激活可誘導血管內皮細胞生長，加速EMS的發展進程[8]。因此，本研究以PI3K/Akt/NF-κB途徑為切入點，研究BSHXR對EMS大鼠的治療作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，健康未孕雌性，體質量（250±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]。動物飼養于青海大學醫學院動物實驗中心標準動物房，飼養條件：室溫（22±1）℃，濕度 50%±10%，每日定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器 BSHXR由熟地黃6 g，楓香脂 10 g，人工麝香 10 g，蠐螬 10 g，土鱉蟲 10 g，五靈脂 6 g，制何草烏 6 g，乳香 10 g，虻蟲 10 g，當歸 6 g組成，由本院藥劑科制備成含生藥量2 g/mL的水煎液；PI3K抑制劑LY294002（英國Abcam公司，貨號：ab120243）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R0896c）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（美國 Thermo scientific 公司，貨號：K1621、K0252）；血小板-內皮細胞黏附分子（CD31）、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、核因子 κB（NF-κB）p65 兔單抗（美國CST 公司，貨號：77699、17366、17366、4685、4060、8242）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）（IgG-HRP）（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：A0208）；雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24KS）；顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：IX53）；多功能凝膠成像系統（Syngene，型號：G：BOX）；7500型PCR儀（美國AppliedBiosystems公司）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，型號：Multiskan MK3）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法 參考文獻方法建立EMS大鼠模型[9]：大鼠適應性喂養1周后，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉，固定、備皮、消毒，在下腹正中處打開腹腔，分離子宮，剪取右側子宮角的部分組織并剝離子宮內膜，用活檢穿孔器取2個面積為5 mm×5 mm的片段，移植于腸系膜動脈血管處，盡量遠離切口。使用慶大霉素沖洗腹腔，逐層關腹，縫合切口。術后3 d內，大鼠腹腔注射0.1 mL慶大霉素防止感染。造模4周后，開腹觀察大鼠移植物呈橢圓形或圓形的囊性結節，高度≥2 mm，并且表面有大量血管形成，與周圍組織黏連緊密，表明造模成功，共成功造模50只大鼠。

1.3.2 分組與給藥 將建模成功的EMS大鼠隨機分為模型組、BSHXR高、中、低劑量組、LY294002組，每組10只，另取10只大鼠作為假手術組，僅開腹剪開子宮組織，隨后縫合。造模4周后開始給藥，按照人與大鼠體表面積折算等效劑量，中劑量為7.56 g/kg，高劑量為 15.12 g/kg，低劑量為 3.78 g/kg，BSHXR低、中、高劑量組大鼠按照上述劑量灌胃給藥，假手術組和模型組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，LY294002組大鼠腹腔注射0.04g/kg的LY294002溶液，每日1次，連續28 d。

1.3.3 EMS大鼠異位子宮內膜病灶體積檢測 末次給藥后24 h，使用游標卡尺測量各組大鼠異位子宮內膜病灶的體積。處死大鼠后，腹主動脈取血，置于4℃冰箱中靜置3 h，然后3 000 r/min，離心15 min（離心半徑為12.5 cm），取上清液，用于ELISA試劑盒檢測。剝離大鼠子宮，假手術組分離正常子宮內膜組織，其余各組大鼠分離異位子宮內膜組織，生理鹽水清洗后取1 g用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）及Western blot檢測，其余組織放置于4%多聚甲醛溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）和免疫組化染色。

1.3.4 HE染色觀察異位子宮內膜灶組織病理變化 將大鼠子宮內膜組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4 μm組織切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇及蒸餾水中復水，HE染色，脫水、透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠異位子宮內膜組織病理變化。

1.3.5 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 取各組大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測 TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.6 免疫組化檢測異位子宮內膜組織CD31表達取1.3.3中制備的組織石蠟切片，組織切片首先進行烤片、脫蠟、復水，然后抗原修復、封閉，滴加稀釋的CD31兔單抗（稀釋比例為1∶100），放入濕盒中4℃過夜，次日滴加羊抗兔二抗37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后滴加DAB顯色液，蘇木精染細胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，每組切片于光鏡下拍攝5個視野，通過Image J軟件統計獲得CD31陽性細胞比率并取平均值，LSD-t檢驗分析不同組間CD31陽性表達差異。

1.3.7 RT-qPCR檢測異位子宮內膜組織VEGF及MMP-9 mRNA水平 取大鼠異位子宮內膜組織，加入Trizol裂解液提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA作為熒光定量模版。引物序列見表1。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.8 Western blot法檢測異位子宮內膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達水平 取大鼠異位子宮內膜組織，研磨勻漿后加入裂解液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，蛋白中加入loading buffer，混勻后置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性，然后進行SDSPAGE電泳，轉膜、封閉后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜放入各一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，洗膜，滴加發光液，置凝膠成像儀顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.4 統計學分析 應用SPSS 25.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內膜病灶體積的影響 結果顯示，假手術組大鼠無異位的子宮內膜組織，模型組可見明顯異位子宮內膜病灶形成。與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組大鼠及LY294002組大鼠異位子宮內膜病灶體積均減小，其中，BSHXR降低異位子宮內膜病灶體積的作用呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組與LY294002組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內膜體積的影響Fig.1 Effect of BSHXR on the volume of ectopic endometrium in EMS rats

2.2 EMS大鼠異位子宮內膜組織病理學觀察 HE染色顯示，假手術組大鼠子宮內膜組織完整，上皮細胞排列整齊、有序，細胞核較小，腺體數量和形態正常。與假手術組比較，模型組大鼠異位子宮內膜組織腺上皮細胞和基質細胞密集，細胞核較大，胞漿豐富，腺腔完整。與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組及LY294002組腺上皮細胞胞核體積縮小、不規則，排列松散，形態逐漸變為單層柱狀，內膜腺上皮層變薄。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠子宮內膜組織病理學變化（HE×400）Fig.2 The histopathological changes of endometrium of rats in each group(HE staining×400)

2.3 BSHXR 對 EMS大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 結果顯示，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平顯著高于假手術組，BSHXR低、中、高劑量組大鼠及LY294002組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平均低于模型組，BSHXR各劑量組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平與 LY294002組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較Fig.3 Comparison of serum inflammatory factors of rats in each group

2.4 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內膜組織CD31表達水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠異位子宮內膜組織中CD31陽性細胞比例顯著增加，與模型組比較，BSHXR低、中、高劑量組CD31陽性細胞比例呈劑量依賴性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組CD31陽性細胞比例與LY294002組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠異位子宮內膜組織CD31表達水平比較（IHC，×400）Fig.4 Comparison of CD31 expression in ectopic endometrium of rats in each group(IHC，×400)

2.5 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平的影響 結果顯示，模型組大鼠異位子宮內膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平顯著高于假手術組，BSHXR低、中、高劑量組VEGF、MMP-9 mRNA水平低于模型組，BSHXR各劑量組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。BSHXR高劑量組VEGF、MMP-9 mRNA水平與LY294002組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠異位子宮內膜組織VEGF、MMP-9 mRNA水平比較Fig.5 Comparison of VEGF and MMP-9 mRNA levels in ectopic endometrium of rats in each group

2.6 BSHXR對EMS大鼠異位子宮內膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠PI3K、Akt磷酸化水平顯著增加，胞核中NF-κB p65表達增加，胞質中NF-κB p65表達減少（P＜0.05）。與模型組比較，BSHXR 低、中、高劑量組及LY294002組PI3K、Akt磷酸化水平降低，胞核中NF-κB p65表達降低，胞質中NF-κB p65表達增加，且BSHXR的作用呈劑量依賴性（P＜0.05）。BSHXR高劑量組PI3K、Akt磷酸化水平和NF-κB p65表達與LY294002組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠異位子宮內膜組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達水平比較Fig.6 Comparison of PI3K/Akt/NF-κB pathway protein expression levels in ectopic endometrial tissues of rats in each group

3 討論

EMS屬于臨床常見的良性婦科疾病，生育期女性的發病率較高，該病癥狀易反復且頑固，包括痛經、性交疼痛、月經異常、不孕等，發病易累及盆腔器官甚至全身組織，不僅損害患者個人身體健康，給患者家庭及中國衛生系統也帶來較大的經濟負擔[10-11]。EMS 屬中醫“癥瘕”“不孕”“月經不調”等范疇，血瘀和腎虛分別是EMS的關鍵病機和根本病機，血瘀和腎虛互為因果，相互影響，共同促進EMS的發生和發展[5]。已有多項研究表明，以補腎活血法治療EMS可顯著改善患者月經異常、經期腹痛等癥狀，降低雌激素水平，提高患者生活質量，但其具體作用機制尚不清楚[12-13]。本研究所用BSHXR由熟地黃、楓香脂、當歸、制草烏、人工麝香、土鱉蟲、蠐螬、五靈脂、虻蟲、乳香等藥材組成，具有溫通補腎、活血化瘀之功效。本研究旨在通過EMS模型大鼠觀察BSHXR對EMS的治療作用，探究其作用機制。

本研究結果顯示，模型組大鼠可見明顯異位子宮內膜組織，病理切片顯示該組大鼠異位子宮內膜組織上皮細胞排列相對整齊，細胞核增大，腺腔完整，表明造模成功。使用高、中、低劑量BSHXR治療后，大鼠異位子宮內膜病灶體積均降低，且大鼠異位子宮內膜上皮細胞形態逐漸變為單層柱狀，腺體數量和基質細胞的數量減少，表明BSHXR對EMS具有治療作用，與既往研究結果一致[14]。研究表明，EMS的發生與腹腔免疫監視功能降低和炎癥反應增加密切相關，改善機體炎癥反應能夠抑制異位子宮內膜病灶的生長[15]。TNF-α、IL-1β、IL-6 均是參與機體免疫應答、具有廣泛免疫調節的促炎細胞因子，具有促進異位內膜及間質細胞的增殖、侵襲、轉移及促進血管生成的作用，可導致盆腔局部組織黏連及纖維化，促使EMS異位子宮內膜病灶的形成[16-17]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，使用不同劑量BSHXR治療后，大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低，表明BSHXR可減輕EMS大鼠炎癥反應。

現代研究認為，EMS的發生發展均涉及細胞的黏附、侵襲和血管形成過程，因此，抑制細胞異常的黏附、侵襲和血管形成過程已成為預防EMS的關鍵[18]。MMPs和VEGF是異位子宮內膜在盆腔病變的關鍵因子，其中，MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中活性最強的一員，可降解細胞外基質成分，促進EMS的侵襲和血管形成過程，而EMS患者MMP-9基因的表達水平也往往呈異常增高的狀態，該基因的水平可作為評估EMS嚴重程度的指標[19]。VEGF是一種強效特異性血管生成因子，可直接作用于內皮細胞而促進血管新生，加快在位子宮內膜異常轉移及異位子宮內膜的增生[20]。CD31是內皮細胞特異性標志物，常用于反映血管生成情況[21]。本研究結果顯示，模型組大鼠異位子宮內膜組織CD31陽性細胞比例升高，VEGF、MMP-9 mRNA水平亦顯著升高，使用BSHXR低、中、高劑量治療后，大鼠異位子宮內膜組織中CD31陽性細胞比例和VEGF、MMP-9 mRNA水平均降低，表明BSHXR治療EMS的機制之一可能是抑制CD31、VEGF及MMP-9的表達，抑制EMS黏附、侵襲和血管形成過程。

PI3K/Akt/NF-κB信號通路是一種密切參與到細胞生長繁殖、運動、代謝和免疫應答調節的信號通路，幾乎所有人類和動物腫瘤疾病中均發現了其被活化的現象[22]。PI3K是生長因子受體超家族信號傳導途徑的關鍵分子，可被生長因子、細胞因子和激素與受體酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體結合而激活，激活后的PI3K可進一步活化下游的Akt，而PI3K/Akt通路的表達改變會影響IκB的表達水平，由于IκB是NF-κB的抑制性因子，因此當IκB被抑制后可促進NF-κB的活化，并進一步引起炎癥因子釋放[23-24]。研究表明，PI3K相關信號轉導途徑在EMS中發揮重要作用，抑制該信號通路的活化可改善大鼠EMS相關癥狀[25]。在本研究中，模型組大鼠PI3K、Akt磷酸化水平顯著增加，NF-κB p65轉移入核水平增加，使用BSHXR低、中、高劑量治療后，大鼠異位子宮內膜中PI3K、Akt磷酸化水平降低，NF-κBp65入核減少。為了進一步探究BSHXR治療EMS的作用機制，本研究同時使用了PI3K抑制劑LY294002。LY294002是PI3K的選擇性抑制劑，可阻斷該通路上部分基因和蛋白表達，有研究表明，LY294002可通過抑制PI3K通路對EMS動物產生治療作用，抑制上皮間質細胞的活性，促進細胞凋亡[26-27]。與上述研究結果一致，本研究結果顯示，LY294002對EMS大鼠的治療作用與BSHXR高劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05），提示BSHXR對EMS的治療作用可能是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路活化產生的。

綜上所述，BSHXR可抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的活化，縮小異位子宮內膜病灶體積，改善異位子宮內膜病理學變化，抑制炎癥反應及血管新生過程，下調VEGF和MMP-9的表達。本研究初步揭示了BSHXR治療EMS的作用機制，但EMS是一種多因素疾病，病機復雜，其療效及作用機制仍需進一步結合體外實驗及臨床研究加以闡明。