基于MATLAB設(shè)計(jì)納豆枯草芽孢桿菌快速計(jì)數(shù)與篩選的方法

韓振興，劉丹丹，王夢(mèng)夢(mèng)，余晨銳，胡紫薇，黃志陽(yáng)，聶光軍

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

菌落的總數(shù)指標(biāo)在醫(yī)學(xué)藥物、生物制品、食品安全等很多方面被用來(lái)判斷被細(xì)菌污染的程度和衛(wèi)生質(zhì)量。菌落數(shù)的測(cè)定方法很多，Howard[1]于1881年首次將瓊脂平板培養(yǎng)法用于微生物的檢測(cè)，如今瓊脂平板培養(yǎng)法仍然是國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的微生物檢測(cè)方法之一。該方法通過(guò)觀察肉眼可見(jiàn)的單細(xì)胞菌落，人工計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品中的菌落總數(shù)。雖然成本低、操作簡(jiǎn)單，但工作量大、用時(shí)長(zhǎng)、分析誤差大、效率低，致使實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果滯后[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀已應(yīng)用于各領(lǐng)域，郭佳等[3]提出Microbio 全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)與普通平板計(jì)數(shù)法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異。Smith等[4]應(yīng)用成像站進(jìn)行快速菌落計(jì)數(shù)。梁春梅等[5]將全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀應(yīng)用于乳品檢測(cè)，自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀與目測(cè)法無(wú)顯著性差異，但是樣品顏色及顆粒大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。近幾年，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)[6]測(cè)定細(xì)胞生成物來(lái)測(cè)定菌落總數(shù)和利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)[7]方法測(cè)定抗體含量來(lái)測(cè)定菌落數(shù)，PCR和ELISA方法準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，但儀器復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高，不適用于快速、批量檢測(cè)。

納豆芽孢桿菌合成的蛋白酶可降解酪蛋白,在其平板上形成透明圈，酶活力大小與透明圈大小呈線性關(guān)系。因此，通過(guò)觀察透明圈與菌落面積的比例(圈徑比)即可對(duì)菌落進(jìn)行快速篩選[8]。本方法應(yīng)用MATLAB處理微生物菌落數(shù)字圖片，進(jìn)而開(kāi)發(fā)計(jì)數(shù)與篩選程序，實(shí)現(xiàn)微生物菌落的快速計(jì)數(shù)與篩選。主要研究：在計(jì)數(shù)方面，初步研究了照片采集、菌種濃度和不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的影響；在篩選方面，基于菌落與透明圈部分像素點(diǎn)數(shù)目的比值來(lái)計(jì)算圈徑比的菌株篩選準(zhǔn)確率。本方法有望提升菌落計(jì)數(shù)與篩選的方便性、經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與儀器

試劑與材料：納豆枯草芽孢桿菌(實(shí)驗(yàn)室保藏)，牛肉浸膏、葡萄糖、瓊脂、氯化鈉、蛋白胨和干酪素(均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán))。儀器：PH104A恒溫培養(yǎng)箱、OPPO手機(jī)相機(jī)、SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋、TA-214電子天平、HP GT5820打印機(jī)和打孔器。

1.2 菌種培養(yǎng)

從50 mL培養(yǎng)基中取2.5 mL(即5%的接種量)納豆芽孢桿菌于種子培養(yǎng)基(牛肉浸膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、氯化鈉 5 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)中活化，將培養(yǎng)基放入37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)14 h。將菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋后，分別吸取100 μL稀釋后菌液涂布于固體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、氯化鈉 5 g/L、瓊脂糖15 g/L、pH 7.0)中，37 ℃培養(yǎng)18 h(空白對(duì)照為無(wú)菌水)。再選用合適濃度的活化菌液分別涂布于打孔和未打孔的酪蛋白平板(脫脂奶粉50 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)中，37 ℃培養(yǎng)18 h，拍照留存。

1.3 圖像采集

采集方式：拍照。將待計(jì)數(shù)的培養(yǎng)平板放置于避光紙箱內(nèi)，打開(kāi)箱底的燈補(bǔ)光，將手機(jī)置于培養(yǎng)基正上方合適的位置，對(duì)菌落進(jìn)行拍照[9]。

1.4 圖像處理

(1)二值化。相對(duì)于灰度化的圖片，二值化圖像是沒(méi)有色度梯度的圖片，便于菌落鑒別與計(jì)數(shù)。因此，本方法首先將灰度化照片二值化。應(yīng)用MATLAB將上述菌群照片轉(zhuǎn)化成只有0和1兩個(gè)元素的矩陣的二值圖像，并對(duì)二值圖像中0元素和1元素的總數(shù)以及矩陣中元素的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。對(duì)菌落計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基圖片進(jìn)行處理，菌落為白色，其他部分為黑色。將產(chǎn)透明圈的培養(yǎng)基其圈徑比的計(jì)數(shù)方式分為打孔組和未打孔組，對(duì)于打孔組將孔徑邊緣處理為白色，孔徑和透明圈處理為黑色，未打孔組透明圈處理為黑色，其他部分為白色。

(2)去噪點(diǎn)。噪點(diǎn)即圖像噪聲，在光信號(hào)變換時(shí)易分布不均，在噪音傳播時(shí)會(huì)產(chǎn)生誤差[10]，圖像信號(hào)在生成、傳播以及記錄時(shí)都會(huì)被其干擾，給畫(huà)面分析造成難度。為使畫(huà)質(zhì)更加清晰，需消除圖片中的噪點(diǎn)，并且對(duì)畫(huà)面變形的地方進(jìn)行處理[11]。傳統(tǒng)的圖像去噪點(diǎn)方法大體分為兩類(lèi)：空間域?yàn)V波和頻域?yàn)V波。常用的空間域?yàn)V波方法有均值濾波、中值濾波等。本實(shí)驗(yàn)采用中值濾波的方式對(duì)圖像進(jìn)行降噪處理。

(3)菌落計(jì)數(shù)程序設(shè)計(jì)。菌落計(jì)數(shù)源代碼如圖1所示。在圖1子程序模板[12]的基礎(chǔ)上，更改讀取照片名稱(chēng)以及閾值大小。

圖1 菌落計(jì)數(shù)源代碼

此程序首先讀取模板圖片“rice.png”，將模板圖片二值化處理后，整體讀取二值圖片，統(tǒng)計(jì)元素為1的白色區(qū)域個(gè)數(shù)n，定義一個(gè)橫向矩陣(n)，把n個(gè)白色區(qū)域逐一代入，統(tǒng)計(jì)出每一個(gè)白色區(qū)域元素的個(gè)數(shù)，即區(qū)域(點(diǎn)菌落)大小，去除過(guò)小的雜點(diǎn)區(qū)域，自定義過(guò)大的黏連區(qū)域后，可統(tǒng)計(jì)出平板上的菌落數(shù)。

(4)菌落篩選程序設(shè)計(jì)。其中此子程序的一段如圖2所示。實(shí)際運(yùn)行時(shí)需要更改讀取的照片名稱(chēng)以及閾值大小。為了使透明圈圖片為一個(gè)界限分明、較為理想的圖片，自定義灰度圖片中灰度值大于100的均等于255，小于100的均等于0。

圖2 子程序一段 圖3 子程序二段

子程序二段如圖3所示。經(jīng)過(guò)子程序一段處理后圖片定為tt1，對(duì)該圖片進(jìn)行二值化處理，統(tǒng)計(jì)透明圈像素點(diǎn)總數(shù)a，統(tǒng)計(jì)菌落像素點(diǎn)總數(shù)b。圈徑比公式：

1.5 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)好的平板取出后，以人工計(jì)數(shù)為對(duì)照，比較分析本方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 照片采集對(duì)計(jì)數(shù)的影響

MATLAB處理菌落計(jì)數(shù)照片時(shí)，在稀釋度相同的條件下，以不同的光照強(qiáng)度(強(qiáng)光和弱光)拍取圖片，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及篩選。結(jié)果顯示：強(qiáng)光對(duì)圖片的獲取不利，強(qiáng)光拍攝的圖片整體過(guò)度曝光，易將細(xì)小的菌群忽略；弱光拍攝圖片整體過(guò)暗，易把培養(yǎng)基中的氣泡也拍成菌群；在光源均勻的適當(dāng)高光下，拍出來(lái)的圖片利于軟件處理，基于程序算法可以在最大程度上排除干擾。因此，本文后續(xù)在暗盒強(qiáng)光[13]條件下選擇LED燈帶作為照片拍攝的最佳光源。

2.2 菌體培養(yǎng)時(shí)間的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落分布影響圖如圖4所示。將1 mL稀釋度為10-6菌液涂布于平板中，分別培養(yǎng)21、24、27、30 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示： 當(dāng)培養(yǎng)21 h和24 h，平板上菌落較稀疏時(shí)，能保持有效的計(jì)數(shù)結(jié)果，當(dāng)培養(yǎng)27 h和30 h，菌體較稠密時(shí)，現(xiàn)有的菌落計(jì)數(shù)儀難以維持較為精準(zhǔn)的結(jié)果，且操作重復(fù)性較低；將培養(yǎng)不同時(shí)間后的菌落平板照片，應(yīng)用本方法計(jì)數(shù)后，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時(shí)間較短的情況下，算法程序能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行計(jì)數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，平板上的菌落較濃稠時(shí)，二值化處理的圖片有部分菌落相粘連，對(duì)后面計(jì)數(shù)操作帶來(lái)一定影響，應(yīng)合理地進(jìn)行粘連分割。因此，后續(xù)最佳菌落培養(yǎng)時(shí)間選擇24 h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落分布影響圖

2.3 菌種濃度的影響

在相同的培養(yǎng)條件下，分別將10-1、10-3、10-5這3種高中低稀釋度的菌液接種在培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出平板進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。在菌液稀釋度為10-3、10-5時(shí)，平板上的菌落較為稀疏，人工計(jì)數(shù)法可以保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。在菌液濃度為10-1時(shí)，人工計(jì)數(shù)法工作量較大，誤差較大，難以保持計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。軟件對(duì)拍攝清晰、菌落分布均勻、氣泡較少的菌落圖片分析效果非常準(zhǔn)確，對(duì)于菌落密集及有粘連的平板，為了得到更加精準(zhǔn)的結(jié)果，需要進(jìn)一步對(duì)粘連的菌株進(jìn)行分割。

(1)低濃度(菌液稀釋度為10-5)的影響。菌液稀釋度為10-5時(shí)圖片處理結(jié)果如圖5所示。采用人工計(jì)數(shù)，菌落數(shù)量為65個(gè)；MATLAB處理去除19個(gè)區(qū)域值小于500的域，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 MATLAB處理計(jì)數(shù)1號(hào)統(tǒng)計(jì)表

區(qū)域大小范圍/個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)個(gè)數(shù)/個(gè)菌落個(gè)數(shù)/個(gè)6 000～9 0001315 000～19 00025

(2)中等濃度(菌液稀釋度為10-3)的影響。菌液稀釋度為10-3時(shí)圖片處理結(jié)果如圖6所示。采用人工計(jì)數(shù)，菌落數(shù)量為567個(gè)。MATLAB處理去除25個(gè)區(qū)域值小于100的域，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 MATLAB處理計(jì)數(shù)2號(hào)統(tǒng)計(jì)表

區(qū)域大小范圍/個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)個(gè)數(shù)/個(gè)菌落個(gè)數(shù)/個(gè)1 200～1 500661 500～2 100272 400～2 70029

(3)高濃度(菌液稀釋度為10-1)的影響。菌液稀釋度為10-1時(shí)圖片處理結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌落數(shù)量較多且粘連嚴(yán)重，人工難以進(jìn)行計(jì)數(shù)。 MATLAB處理去除19個(gè)區(qū)域值小于10的域，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

由計(jì)算結(jié)果可知，在高、中、低3種不同稀釋度情況下，本法得出的結(jié)果與人工計(jì)數(shù)相比準(zhǔn)確率均在90%以上，表明本方法的有效性。

表3 MATLAB處理計(jì)數(shù)3號(hào)統(tǒng)計(jì)表

區(qū)域大小范圍/個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)個(gè)數(shù)/個(gè)菌落個(gè)數(shù)/個(gè)600～70048800～1 0003101 200～1 3001151 300～1 4002171 600～1 800120

圖5 菌液稀釋度為10-5時(shí)圖片處理結(jié)果

圖6 菌液稀釋度為10-3時(shí)圖片處理結(jié)果

圖7 菌液稀釋度為10-1時(shí)圖片處理結(jié)果

2.4 基于圈徑比的菌株篩選

圖8a為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)平板圖片，該透明圈的大小合適，人工計(jì)算圈徑比可操作，將原始圖片處理得到二值化圖片輸入到運(yùn)行代碼中即測(cè)得該透明圈的圈徑比P=1.529 3，人工測(cè)得的圈徑比P=1.674 2；精確度=1.529 3/1.674 2×100%=91.34%。

圖8 圖片處理結(jié)果

圖9a為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)平板圖片，該透明圈細(xì)小，人眼難以觀察，篩選工作無(wú)法進(jìn)行。在高光下對(duì)透明圈進(jìn)行拍照取圖,二值化圖片后輸入到運(yùn)行代碼中，可得該透明圈的圈徑比P=6.503 5。由上述結(jié)果可知，本方法與人工計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確率都在90%以上。表明本方法可以快速有效進(jìn)行菌落篩選，一定程度上提升菌種篩選的效率。

圖9 圖片處理結(jié)果

3 討論

本文主要以納豆枯草芽孢桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌來(lái)探究菌落計(jì)數(shù)及篩選方法。利用MATLAB處理數(shù)字圖像開(kāi)發(fā)的菌落計(jì)數(shù)及篩選程序，以人工計(jì)數(shù)的結(jié)果為對(duì)照，比較分析本程序的準(zhǔn)確性。在MATLAB軟件主程序的基礎(chǔ)上進(jìn)行子代碼程序的設(shè)計(jì)，初步完成了菌落計(jì)數(shù)與篩選，探究了圖像采集、菌種濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于本方法準(zhǔn)確性的影響。未來(lái)，可以通過(guò)較為復(fù)雜的子程序設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)菌落照片的自動(dòng)化處理及提高準(zhǔn)確性。進(jìn)一步改進(jìn)子程序，處理較為復(fù)雜的圖像，針對(duì)粘連圖片建立多種應(yīng)答機(jī)制，是本方法持續(xù)改進(jìn)的一個(gè)方向。