一株強抗逆性豬源乳酸菌的篩選及生物學特性研究

蔡 爽， 陳 濤， 毛宗林， 楊鳳娟， 宋青龍

（1.國家飼料工程技術研究中心，北京100193；2.貴州大北農牧業科技有限公司，貴州貴陽550025）

仔豬養殖階段的腹瀉率與死亡率高是造成養殖業經濟損失的重要因素之一， 尤其是仔豬斷奶后極易引起動物消化道微生態紊亂， 感染病原微生物，造成仔豬腹瀉、生長停滯甚至死亡（任曼等，2014）。抗生素在改善畜禽生長性能以及疾病防治方面具有重要作用， 在世界各國被廣泛應用已有幾十年的歷史， 但長期在飼料中使用抗生素會造成畜禽腸道菌群紊亂， 會加劇耐藥性細菌或超級耐藥性細菌的產生和擴散， 導致嚴重的人和畜禽生物安全、 環境污染和食品安全等一系列的問題（Yi 等，2017；Falagas 等，2012；Cho 等，2012；Larsson 和Wolk，2010）。 因此，我國決定自2020 年7月全面禁止促生長類藥物飼料添加劑在飼料中的使用，但這對畜牧業生產將是一個嚴峻的挑戰。

乳酸菌是人及動物腸道中正常菌群的一部

分， 在調控畜禽腸道健康、 保持胃腸道微生態平衡、提高畜禽生長性能等方面發揮重要作用（Chiquette，2009；Timmerman 等，2006）。但天然乳酸菌的熱穩定性較差，在飼料的加工過程中難以存活。并且天然乳酸菌不耐胃酸及膽鹽， 進入動物胃部30 min 后存活率極低，最終順利到達腸道的活菌數非常少， 難以定植在腸黏膜發揮作用（郭志杰等，2010；黃滄海等，2004），這些因素限制了乳酸菌在實際生產中的應用。 因此，篩選耐酸、耐高溫且有益生特性的乳酸菌，對解決仔豬腹瀉、飼料中抗生素用量大等問題具有重要意義。 本研究以健康無病仔豬宿主為篩選載體， 從健康仔豬糞便中初步分離出備選菌株， 并進行嚴格篩選和16S rRNA 進化分析。 通過抗逆性和益生特性選育，并系統地研究該菌株生長曲線和生理生化特性，為其發酵和應用提供重要理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 用以分離和篩選菌株的樣品均來自健康無病仔豬的糞便。培養基包括MRS 肉湯培養基、麥康凱培養基、M17 培養基和糖醇發酵培養基。

1.2 菌株的分離與鑒定 稱取1 g 健康仔豬的新鮮糞便，加入9 mL 生理鹽水，室溫下振蕩混勻。 對混合液進行梯度稀釋， 均勻涂布于含有10 mg/kg放線菌酮的MRS 瓊脂培養基及M17 瓊脂培養基平板上。 37 ℃恒溫培養72 h 后，選取生長良好的特征單菌接入MRS 液體培養基，反復劃線純化至獲得純菌株。

16S rRNA 基因序列分析： 選用細菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京，中國）進行細菌總DNA 的提取，并采用細菌通用引物進行16S rRNA 擴增。 擴增反應體系（50 μL）如表1 所示。

表1 PCR 擴增體系

擴增程序為：95 ℃5 min；94 ℃1 min；58 ℃1 min；72 ℃2 min，進行30 個循環，72 ℃10 min。之后進行1%瓊脂糖凝膠電泳， 選取片段長度1500 bp 左右的陽性產物純化后測序 （中美泰和生物技術（北京）有限公司），在NCBI 數據庫中進行同源性比對， 并通過MEGA 4.0 與模式菌種進行親緣關系研究，選取同源性大于99%為種的分界閾值。

1.3 革蘭氏染色和接觸酶試驗 取少量MRS 肉湯培養物置于載玻片上，烘干固定后，依次用結晶紫染色液染色1 min， 革蘭氏碘液染色1 min，丙酮乙醇混合液（丙酮：95%乙醇= 3：7）脫色30 s，沙黃染色液復染1 min， 然后在光學顯微鏡下觀察。 選取具有革蘭氏陽性形態的桿菌進一步進行接觸酶試驗，具體步驟為：取0.2 mL 培養物接入MRS 瓊脂培養基斜面，在5% CO2、37 ℃條件下培養24 h 后，滴加3%過氧化氫溶液于菌落上，觀察是否有氣泡產生，若有則為革蘭氏陽性菌，若無則為革蘭氏陰性菌。

1.4 菌株生長曲線繪制 按1%（V/V） 將待測菌株接種于MRS 肉湯培養基，同時設置空白對照組（不加待測菌株）。將培養基置于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，并每小時測定OD600值，進行菌株生長曲線的繪制。

1.5 菌株的抗逆性選育 耐熱試驗：將待測菌株按2%（V/V）接種到MRS 液體培養基中，分別在不同溫度（60、70、80 ℃）下孵育10 min。 孵育結束后立即置于室溫下冷卻，進行活菌數的測定。

耐酸試驗： 將待測菌株按2%（V/V） 接種到pH 3.0 的MRS 液體培養基中，在接種0、1、2 h 和3 h 后吸取菌液涂板。 將平皿置于37 ℃恒溫培養24 h，進行菌落計數，并計算酸處理后的存活率。

耐膽鹽試驗：將0.3%（m/V）或1.0%（m/V）牛膽酸鈉加入MRS 培養基并搖勻，制成不同膽鹽濃度的MRS 固體培養基。將待測菌株倍比稀釋后接入平皿，同時設置對照組（不含牛膽酸鈉）。將平皿置于37 ℃恒溫培養48 h，進行菌落計數，并計算膽鹽處理后的存活率。

耐貯藏試驗： 將pH 6.7 的MRS 培養基置于Hungates 滾管中， 制成厭氧無菌肉湯。 每管中加1 mL 待測菌株，于37 ℃恒溫培養箱中進行培養。分別于0、24、72、104、128 h 和176 h 吸取菌液，梯度稀釋后均勻涂布于MRS 培養基。將平皿置于37 ℃恒溫培養24 h，進行菌落計數。

抗生素抗性試驗：將金霉素、磺胺二甲嘧啶、泰樂菌素、速大肥、乙酰甲喹、阿散酸、桿菌肽鋅、洛克沙砷、牛至油、喹乙醇、三甲氧芐氨嘧啶、抗敵素和吉他霉素13 種抗生素分別加入到滅菌的MRS 培養基中，將待測菌株按2%（V/V）接種到含不同抗生素的MRS 液體培養基中，37 ℃培養24 h，觀察其菌落生長情況。

1.6 與致病菌混合培養試驗 將待測菌株接入MRS 肉湯培養基，37 ℃培養24 h 后， 取5 mL 培養物（8.2×109cfu/mL）分別與5、10、15 mL 營養肉湯混合， 制成3 個含不同菌株培養物濃度的營養肉湯，分別接種傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K88 和O157， 接種量為培養液的10%，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h 后，觀察結果。

1.7 抑菌試驗 以嗜水氣假單胞菌（CVCC519）、綠 膿 桿 菌 （CMCCB10102）、 大 腸 桿 菌（ATCC25922）、雞白痢沙門（CVCC519）、枯草芽孢桿 菌 （CICC 20076）、 熒 光 假 單 胞 菌（CGMCC 1.1802）、李斯特桿菌（CVCCC53-5）、化膿鏈球菌（ATCC19615）、鼠傷寒沙門（CVCC2212）、巴氏桿菌（CVCC464）、金黃色葡萄球菌（CVCC1882）為指示菌，測定待測菌株的抗菌活性。 取無菌培養皿，用1.5%滅菌的瓊脂鋪底，然后將滅菌的牛津杯放置在凝固的瓊脂上。 將指示菌接入LB 培養基，原菌液濃度為107cfu/mL，待測菌株菌液濃度為108cfu/mL，然后將LB 含指示菌一起倒到裝有牛津杯的板上，待LB 凝固后用無菌鑷子取出牛津杯，試驗孔打入待測菌，然后將培養皿放在37 ℃恒溫培養箱培養12 ～24 h，最后記錄抑菌圈大小以檢測待測菌株對各指示菌的抗菌活性。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定 試驗以健康無病仔豬為宿主，對其糞便樣品中的微生物進行分離純化，并結合革蘭氏染色和接觸酶試驗， 最終獲得5 株乳酸菌， 分別命名為NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4 和NFER-5。 將5 株乳酸菌和4 株模式菌株的16S rRNA 基因序列通過MEGA 4.0 軟件進行對比，并繪制系統進化樹，以同源性大于99%為種的分界閾值，對其進行鑒定。 結果表明，NFER-1和 NFER -4 與Lactobacillus parabuchneriJCM12493 具有高度相似性， 歸屬為Lactobacillus parabuchneri；NFER -2 與Streptococcus thermophilus的同源性為99%， 與Streptococcus thermophilusATCC19258 也處于同一分支， 判定為Streptococcus thermophilus；NFER-3 與Lactobacillus plantarumNCDO1752 處于同一亞群，結合同源性結果，判定其為Lactobacillus plantarum；NFER-5 與Enterococcus faeciumLMG11423 處于同一分支，因此被判定為Enterococcus faecium（圖1）。

圖1 菌株的聚類分析圖

2.2 菌株的抗逆性選育

2.2.1 耐熱性能選育 通過將分離純化出的5 株菌株分別在不同溫度條件下（60、70、80 ℃）處理10 min， 檢測菌株對高溫環境的敏感性。 結果表明，經過60 ℃熱處理10 min 后，5 株菌株都可以穩定的存在，但是NFER-3 的數量減少最多。 經過70 ℃熱處理10 min 后，NFER-1 和NFER-3全部死亡， 表明這兩株菌株耐熱性能差；NFER-2、NFER-4 和NFER-5 都 還 存 在 活 菌， 其 中NFER-5 存活的活菌數最多。 經過80 ℃熱處理10 min 后，NFER-1、NFER-2、NFER-3 和NFER-4 均死亡，僅有NFER-5 仍有較高活菌數（表2）。因此，通過對5 株菌進行耐熱性能的選育后，最終選定NFER-2、NFER-4 和NFER-5 進行 后續的抗逆性篩選。

表2 不同溫度條件下處理10 min菌株的存活情況cfu/mL

2.2.2 耐酸性能選育 通過將候選的NFER-2、NFER-4 和NFER-5 菌株在pH 3.0 的條件下分別處理1、2 h 和3 h，檢測菌株對酸性環境的敏感性。 結果表明， 酸處理1 h 后，NFER-2、NFER-4和NFER-5 三株菌均能存活， 其中菌株NFER-5的存活數最多。 酸處理2 h 后，NFER-2、NFER-4和NFER-5 三株菌仍有少量存活。酸處理3 h 后，菌株NFER-2 全部死亡，菌株NFER-4 存活數極低， 表明NFER-2 和NFER-4 的耐酸能力較弱；但菌株NFER-5 表現出較強的酸耐受性，在酸處理3 h 后，存活率仍達到80%（表3）。 因此，通過對3 株菌進行耐酸性能的選育后， 最終選定NFER-5 進行后續的抗逆性篩選。

表3 pH 3.0 條件下菌株的存活率

2.2.3 耐膽鹽性能選育 經過0.3%和1.0%膽鹽濃度處理后，菌株NFER-5 的存活率見表4。結果表明，NFER-5 在膽鹽濃度為0.3%和1.0%的條件下都表現出較強的耐受性， 存活率分別達到了109.95%和47.39%。

表4 不同膽鹽濃度條件下NFER-5 菌株的存活率

2.2.4 耐貯藏性能選育 NFER-5 在不同貯藏時間的活菌數及存活率見表5。 結果表明，NFER-5在37 ℃恒溫培養的環境下穩定性較好，培養72 h后菌株的存活率仍高達75%， 培養176 h 后，NFER-5 仍保持較高的活菌數， 存活率仍有28.33%，數量為6.8×109cfu/mL。這一結果說明，菌株NFER-5 具有較好的穩定性。

表5 NFER-5 菌株在不同貯藏時間的活菌數及存活率

2.2.5 抗生素抗性選育 NFER-5 菌株對多種抗生素抗性結果如表6。 結果表明，NFER-5 在含有喹乙醇、牛至油、洛克沙砷、桿菌肽鋅、阿散酸、金霉素和抗敵素的培養基中可以生長正常， 表明NFER-5 對這些抗生素具有抗性； 然而，NFER-5在含有乙酰甲喹、速大肥、泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶、 三甲氧芐氨嘧啶和吉他霉素的培養基中不生長，表明NFER-5 對這些抗生素敏感。

表6 NFER-5 菌株對各種抗生素的抗性測定

2.3 屎腸球菌NFER-5 的益生特性選育

2.3.1 屎腸球菌NFER-5 與致病菌混合培養試驗將屎腸球菌NFER-5 與各致病菌混合培養，檢測菌株對致病菌的抑制效果。結果如表7 所示，在不同濃度下，屎腸球菌NFER-5 能夠在自身生長不受影響的情況下， 使培養基中傷寒沙門氏菌的活菌數由108減少至102，表明其對傷寒沙門氏菌有較好的抑制效果。 在不同濃度下， 屎腸球菌NFER-5 對大腸桿菌K88 和O157 也有一定的抑制作用， 能夠使培養基中大腸桿菌K88 和O157的活菌數由108減少至105，且屎腸球菌NFER-5自身生長不受影響。 但是，試驗結果表明，屎腸球菌NFER-5 對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果，不同濃度的屎腸球菌NFER-5 均沒有影響金黃色葡萄球菌的生長。

表7 屎腸球菌NFER-5 與致病菌混合培養后的生長情況cfu/mL

2.3.2 屎腸球菌NFER-5 的抑菌特性 通過牛津杯試驗， 檢測屎腸球菌NFER-5 對大腸桿菌、雞白痢沙門等多種病原菌的抑菌效果。 試驗結果表明，屎腸球菌NFER-5 對巴氏桿菌（CVCC464）、鼠傷寒沙門（CVCC2212）、雞白痢沙門（CVCC519）、大 腸 桿 菌 （ATCC25922） 和 綠 膿 桿 菌（CMCCB10102）都有較強的抑菌作用，能觀察到明顯的抑菌圈。 其中抑菌效果最為明顯的是雞白痢沙門（CVCC519），抑菌圈直徑達到20.43 mm（表8）。

表8 屎腸球菌NFER-5 發酵液上清對指示菌抑菌直徑測定mm

2.4 屎腸球菌NFER-5 的生長曲線 在培養過程中，每小時檢測菌液OD600值，繪制NFER-5 的生長曲線。 如圖2 所示， 在培養2 h 后，NFER-5進入對數生長期； 培養10 h 后，NFER-5 進入穩定期。 因此，該菌株的最佳收獲期為培養后10 ～18 h。

圖2 NFER-5 的生長曲線

2.5 屎腸球菌NFER-5 的生理生化特性NFER-5 的生理生化特性如表9。 結果表明，NFER-5 發酵葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、水楊苷、阿拉伯糖、海藻糖、纖維二糖、淀粉、 龍膽二糖等多種糖類產酸不產氣， 判定NFER-5 為腸球菌屬（Enterococcus）。

表9 NFER-5 的生理生化特性

3 討論

屎腸球菌廣泛存在于自然界，屬于兼性厭氧的乳酸菌， 以活菌的形式廣泛應用于動物飼料產品中。 屎腸球菌會產生過氧化氫、有機酸和細菌素等代謝產物。這些代謝產物一方面可以直接影響宿主的代謝，提高機體的免疫力，改善畜產品品質；另一方面， 也可以通過調控宿主的腸道微生物區系，有效抑制腐敗菌和病原菌的生長， 促進有益菌的繁殖，間接影響宿主的健康（沈中艷等，2007）。

益生菌活菌都有適宜自身生長的特殊生長環境，惡劣的環境會使其生長緩慢、停滯，甚至死亡。在飼料生產過程中，調質、制粒的溫度和壓力是制約微生態制劑中活菌數量的關鍵因素之一， 也是活菌制劑質量的關鍵步驟。此外，活菌被動物采食后，還要經受動物消化道中消化液的考驗。 因此，本研究在篩選過程中同時兼顧了胃酸和膽鹽兩個影響因素，結合溫度耐受性試驗和耐貯藏性能，使篩選出的目標菌株不僅能耐受飼料加工過程中的惡劣環境， 對胃酸和膽鹽等消化道環境具有較高的耐受性，而且能夠較長時間貯藏。一般仔豬飼料的制粒溫度為70 ～85 ℃， 本研究篩選出的屎腸球菌NFER-5 在80 ℃處理10 min 后， 仍有較高的存活率，表明其具有良好的耐熱性，在飼料加工過程中的損失少。同時，屎腸球菌NFER-5 在pH 3.0 和膽鹽濃度0.3%或1.0%的環境下均能夠穩定存活， 確保了該菌株進入動物消化道后能經受酸性環境和膽鹽的刺激， 能夠成功達到腸道發揮其益生功能。

大腸桿菌、 傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是極為常見的條件性致病菌， 也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因 （Mirhoseini 等，2018；Fairbrother和Nadeau，2005；Kaper，2005）。 研究證實，產腸毒素大腸桿菌在侵入宿主后， 可以通過自身表達產生的黏附素黏附到特定的小腸上皮細胞刷狀緣受體上，之后開始快速定植、生長和繁殖，并分泌腸毒素，釋放脂多糖，從而引發腹瀉、腸道微生物紊亂、腸炎和腸道屏障損傷。 據報道，豬源常見的產腸毒素大腸桿菌菌毛基因型是K88（F4）、K99（F5） 和987P （F6）（Zhang 等，2017； 黃滄海等，2005）。 目前普遍認為，益生菌改善動物健康的主要方式是競爭性黏附及分泌殺菌物質調節宿主微生物區系， 或通過表面大分子與宿主腸道黏膜中識別受體互作，傳遞信號，從而調節腸道內環境、宿主免疫、 物質代謝及生長性能 （黃滄海等，2005）。 益生屎腸球菌調控宿主健康的方式主要有：（1）通過影響膽汁酸代謝，降低血清膽固醇水平；或通過產生短鏈脂肪酸及維生素，增強宿主的能量代謝率。（2）以競爭性黏附或分泌抑菌物質的途徑，干擾腸道中病原微生物的繁殖，改善腸道菌群的微生態平衡。（3）刺激先天性免疫細胞和T、B淋巴細胞， 調控宿主的免疫功能 （Leblanc 等，2017；Ridlon 等，2016；Lebeer 等，2010）。本研究通過將篩選出的屎腸球菌NFER-5 與大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等致病菌混合培養，探究了屎腸球菌NFER-5 對大腸桿菌、雞白痢沙門等病原菌的抑菌效果， 證實了候選菌株對致病性大腸桿菌K88 和O157 以及傷寒沙門氏菌均有較好的抑制效果， 并且能夠顯著抑制大腸桿菌（ATCC25922）、雞白痢沙門（CVCC519）、鼠傷寒沙門（CVCC2212）、巴氏桿菌（CVCC464）和綠膿桿菌（CMCCB10102）的生長。 這一結果與目前大多數關于屎腸球菌的研究結果一致。 屎腸球菌的代謝產物細菌素對志賀氏菌、沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌和葡萄球菌都具有較好的抑制作用， 而且屎腸球菌代謝產生的乳酸可以顯著降低動物的腸道酸度， 從而抑制病原菌在腸道的生長（Connell，2007）。針對健康仔豬和腹瀉仔豬的腸道菌群進行對比研究發現，與健康仔豬相比，腹瀉仔豬腸道中大腸桿菌數量顯著增加， 而乳酸桿菌的數量顯著降低（黃滄海等，2003）。 日糧中添加屎腸球菌，斷奶仔豬的生長性能得到顯著提升， 仔豬的特異性免疫和非特異免疫功能均得到一定程度的改善，且調控了仔豬腸道菌群結構（文靜等，2011）。在用大腸桿菌、金黃的葡萄球菌、綠膿桿菌、雞白痢沙門、 鼠傷寒沙門、 巴氏桿菌感染所作的試驗模型中，都證明了屎腸球菌具有抗感染活性。補充屎腸球菌，可通過提高緊密連接蛋白Claudin-4 表達、調控炎癥反應， 從而減輕產腸毒素大腸桿菌對豬腸道的侵襲（Kern 等，2017）；提高仔豬腸道絨毛高度及絨毛高度和隱窩深度比， 增加腸上皮內淋巴細胞的數量（Rieger 等，2015）。這些結果都證實了屎腸球菌具有良好的益生性能， 具有較大的發展空間和應用價值。

4 結論

通過本試驗的抗逆性選育，確定NFER-5 在耐高溫、耐膽鹽、耐酸、耐貯藏等方面具有較大優勢，是一株可用于微生態制劑的優勢菌種，并鑒定為屎腸球菌。 本試驗篩選出的屎腸球菌對大腸桿菌（ATCC25922）、綠膿桿菌（CMCCB10102）、雞白痢沙門（CVCC519）、鼠傷寒沙門（CVCC2212）和巴氏桿菌（CVCC464）有較強的抑制作用，是一株優良的微生態制劑用菌株。