腸桿靈散及球蟲血痢散對雞腸道微生物菌群結構多樣性影響比較試驗研究

文正常， 吳玙彤 ， 王 璇， 潘淑惠， 吳 仙， 張楊子

（貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽550005）

“球蟲血痢散” 具有殺蟲、止血、清熱燥濕、澀腸止瀉之功效， 主要用于禽小腸球蟲或盲腸球與致病性大腸桿菌混合感染性疾病的生產防治；“腸桿靈散” 具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止痢、健脾理氣之功效， 主要用于禽原發或繼發性大腸桿感染性疾病的生產防治。 藥物體外抑制及防治試驗研究表明（文正常等，2012a、2012b），“球蟲血痢散”對禽致病性大腸桿菌、球蟲孢子化卵囊增殖均有顯著抑制作用， 對禽致病性大腸桿菌CVCC-245 株的抑菌直徑為4.8 ~ 6.6 mm；“腸桿靈散”對禽致病性大腸桿菌CVCC-245 株的抑菌直徑為4.2~ 6.5 mm，臨床防治應用治愈率為92.3%。 為進一步探討兩個中草藥組方藥物使用對禽腸道菌群結構多樣性及調整腸道內環境微生態菌群平衡的作用及影響， 并與禽腸道常用抗生素藥物硫酸安普霉素進行比較， 本試驗以貴州小香雞為研究對象，開展7 d 連續藥物飼喂試驗，經雞腸道內容物細菌總DNA 提取、PCR 擴增及Miseq 高通量宏基因組序列測定，分析微生物菌群厚壁菌門、變形桿菌門的Chao1、ACE 指數變化情況和種（species）水平相對豐度，對試驗藥物在雞腸道菌群的自然組成結構影響進行整體評價。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理 貴州省地方小香雞3號24 只，雌雄各半，體重（1.5±0.5）kg/羽，購于修文縣某肉雞養殖場。 本試驗在貴州省畜牧獸醫研究所動物實驗室進行。 按肉雞常規飼養程序進行飼養管理，5 層階梯式籠養，自由采食和喂水。

1.2 試驗藥物 “腸桿靈散”制劑藥物組方主要為黃連、黃柏、鉤藤、大黃、梔子、白頭翁、蒼術、厚樸、枳殼、秦皮；“球蟲血痢散”中草藥組為青蒿、常山、鉤藤、黃柏、梔子、穿心蓮、紫花地丁、陳皮、甘草，由貴州省畜牧獸醫研究所提供，委托項目協作單位山東濟南華神動物藥業有限公司代加工生產。規格：1 kg/包，生產日期：2019 年10 月21 日，有效期2 年。 硫酸安普霉素為10%水溶性粉劑，購自山東濟南華神動物藥業有限公司，批文號：獸藥字151152745，生產批號20191002。

1.3 試驗設計 選擇4 月齡24 只土雞隨機分成4 組，1 組為腸桿靈散試驗組，2 組為空白對照組，3 組為球蟲血痢散試驗組，4 組為硫酸安普霉素試驗組； 除對空白對照組按正常飼料喂養外， 試驗1、3 組分別按每只雞2 g/d 中草藥純粉拌飼料自由采飼，試驗4 組按100 g 兌水150 kg 比例白天自由飲水；各藥物試驗組連續給藥1 周，第8 天停藥讓藥物代謝， 第9 天屠宰取食糜樣本進行高通量測序。 試驗分組及給藥方案見表1。

表1 試驗動物分組及給藥方案

1.4 雞腸道微生物菌群宏基因組檢測

1.4.1 樣品采集 將雞屠宰后取后1/3 大腸段內容物于15 mL 無菌無酶EP 管中，-80 ℃超低溫冰箱保存備用。 將采集的腸道內容物樣品用干冰保存送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司試驗檢測，針對樣品進行PCR 測序。

1.4.2 樣品細菌總DNA 提取 采用CTAB 或SDS 方法對樣本的基因組DNA 進行提取， 之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中， 使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據測序區域的選擇， 使用帶Barcode 的特異引物進行PCR， 確保擴增 效率和準確性 （DeSantis 等，2006）。

1.4.3 PCR 擴增建庫 根據PCR 產物濃度進行等量混樣， 充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，對目的條帶使用qiagen 公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用DNA 黏合酶將測序接頭連接在擴增好的DNA 片段兩端， 使用AMpure PB 磁珠對DNA 片段進行純化選擇，構建SMRT Bell 文庫。 純化后的片段經buffer 回溶后，使用BluePipin 片段篩選特定大小的片段，并利用AMpure PB 磁珠對DNA 片段進行純化。構建好的文庫經Qubit 濃度定量，并利用Agilent 2100 檢測插入片段大小，隨后用PacBio 平臺進行測序（Ondov 和Nicholas，2011）。

1.4.4 宏基因組測序 利用PacBio 測序平臺對目的片段進行高通量測序， 根據barcode 序列區分各樣本的數據（Li 等，2013），得到的Reads 需要進行去除嵌合體序列的處理，Reads 序列通過（UCHIME Algorithm）（Lozupone 等，2011） 與全長注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列， 并去除其中的嵌合體序列（Lozupone 等，2007），得到最終的有效數據（Clean Reads）。 并對測序結果進行生物信息學分析， 闡述各組試驗動物腸道微生物的種類與結構，及解析腸道微生物對藥物反應的影響。

1.5 數據處理與分析 利用CCS 軟件對序列進行校正， 得到最終有效數據（Edgar，2013；Quast等，2013）。 再通過去雜拼接、質量控制、篩選并去除嵌合體序列步驟后， 使用Uparse 軟件（Magali等，2013）將序列聚類默認為97%的一致性（Identity）成為OTUs。 計算豐度指數和多樣性指數，并進行主坐標分析（Wang 等，2007）， 采用SPSS 進行方差分析。

2 試驗結果

2.1 對雞大腸微生物菌群多樣性的影響 由表2可知，R1、R3 及R4 各藥物試驗組的OUT 數量分別為54.33、50.33 和33.67， 數量最少的是R2 空白對照組，為25.67，說明藥物試驗組服藥后可使雞腸道微生物菌群多樣性提高，微生物種類增多，均勻性更高，并且各組樣品之間存在差異。組間樣品 中R1 （ACE=58.48，Chao1=66.67，Shannon=3.17） 和R3 （ACE=50.33，Chao1=87，Shannon=3.11）組菌群多樣性指數顯著高于R4 組和R2 空白對照組，R2 空白對照組 （ACE=43.96，Chao1=51.33，Shannon=1.68）最低。

表2Alpha 多樣性分析也指出，3 組服用藥物雞只的腸道內容物中腸道菌群的多樣性均高于空白對照組，各組之間存在顯著差異（P＜0.05）。R1、R3、R4 藥物試驗組的Shannon 指數分別為3.17、3.11和2.97，R2 空白對照組為1.68，表明R1、R3、R4 組腸道的微生物多樣性高于對照組。 而R1、R3、R4 藥物試驗組的Simpson 值分別為0.6301、0.6336和0.6381，R2 空白對照組為0.6934， 表明各藥物試驗組的腸道微生物多樣性也高于試驗對照組 （Simpson 值越低表示菌落多樣性越高）；從ACE 值（60.09）顯示，R3 組最為突出；各組之間Coverage 的值均在0.97 以上，說明樣品序列中未被檢測到的可能性極低。

表2 各組樣品中菌群的OTU 值及Alpha 多樣性

2.2 主坐標分析（PCoA） 主坐標分析反映各樣本中菌群構成的相似性。 基于Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac 距離來進行PCoA 分析（Muscle，2004；McArdle 等，2001），并選取貢獻率最大的主坐標來進行作圖展示。 如果樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起， 群落差異大的樣品則會遠遠分開。在本試驗條件下，各試驗組檢測樣本中菌群落分布區域不同， 而各自重復點相對能靠攏在一起（圖1a），說明處理間群落構成存在差異性。 基于Weighted Unifrac 距離的PCoA分析結果顯示 （圖1b），R2 組與R1、R3 組和R4組間距離較遠， 表明R2 組與R1、R3 組及R4 組間的菌落構成差異較大，R1 組、R3 組和R4 組之間的菌落構成差異較小。

圖1 各組樣品中Unweighted Unifrac距離PCoA 分析

2.3 基于門分類水平的分析 4 組樣品中的菌群組成在門（phylum）水平上最大豐度排名前10 的物種水平見表3 和圖2。 各組樣本生成的OUT 主要由變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體菌門（Spirochaetes）6 個門構成，其中以變形桿菌門（Proteobacteria）、厚 壁 菌 門（Firmicutes）2 個 菌 門占主導地位，所占比例在80%以上。 其他門類占比均不足1%；空白對照R2 組主要檢測到的變形菌門占比顯著高于試驗R1 組、 R2 組和R3 組；厚壁菌門（Firmicutes）所占比例顯著低于R1 組、R3 組和R4 組。 由此可見，各試驗組用藥后雞只腸道菌群的組成結構較空白對照組發生了明顯變化，其中，變形菌門均呈顯著下降趨勢，厚壁菌門占比呈顯著上升趨勢（P< 0.05），均有利于增加厚壁桿菌門（Firmicutes）的數量，從而使腸道菌群的平衡紊亂得到改善。

表3 各組樣品對腸道微生物在門水平上的影響

2.4 基于種分類水平的分析 4 個試驗組檢測樣品中菌群組成在種（species）水平上以最大豐度排名前10 如表4。 結果顯示， 以非解乳糖鏈球菌FGM（Streptococcus）、盲腸腸球菌（Enterococcuscecorum）、大腸桿菌（Escherichia-coil）、唾液乳桿菌（Lactobacillus-salivarius）、 約氏乳桿菌（Lactobacillus-johnsonil）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）6 種菌種為主。R1 組主要優勢菌種為非解乳糖鏈球菌FGM（49.7%）、盲腸腸球菌（4.1%）、唾液乳桿菌（8.7%）、約氏乳桿菌（14.6%）、羅伊氏乳桿菌（2.7%），其中非解乳糖鏈球菌FGM 所占比例顯著高于其余三個試驗組。R3 組主要優勢菌種為非解乳糖鏈球菌FGM （21.2%）、 盲腸腸球菌（6.2%）、 唾液乳桿菌 （11.2%）、 約氏乳桿菌（9.2%）、羅伊氏乳桿菌（4.2%）；R4 組主要優勢菌種為非解乳糖鏈球菌FGM（40.8%）、唾液乳桿菌（7.8%）、 約氏乳桿菌 （9.1%）、 羅伊氏乳桿菌（7.7%）； 空白對照R2 組主要優勢菌種為非解乳糖鏈球菌FGM（22.8%）、盲腸腸球菌中（16%）、唾液乳桿菌（7.4%）、約氏乳桿菌（7.2%）。表明R1 組可顯著提升非解乳糖鏈球菌FGM、約氏乳桿菌的比例；R1、R3、R4 藥物試驗組對降低埃希氏-大腸桿菌的比例均優于R2 組， 且腸道內優勢菌屬數量增多；雖然R4 組能顯著降低腸道內埃希氏-大腸桿菌比例， 但微生物種類含量比例低于藥物試驗R1 組和R4 組，且均勻性低。

表4 各組樣品對腸道微生物在種水平上的影響

3 小結與討論

本試驗研究結果表明，試驗用“球蟲血痢散”、“腸桿靈散”和硫酸安普霉素藥物能顯著增加雞腸道有益菌群中的厚壁菌門豐度比例， 降低變形桿菌門在菌群中的比例。 其中“腸桿靈散”試驗組中非解乳糖鏈球菌FGM 的豐度占比為49.7%，是本組試驗中雞腸道內豐度比例最高的的菌群， 屬于腸道有益菌， 這與研究報道一致 （吳開開等，2020）。 同時3 個藥物試驗組對降低埃希氏-大腸桿菌的比例顯著優于空白對照試驗組。 由此表明3 個試驗藥物對抑制雞大腸桿菌感染和調整雞腸道菌群平衡紊亂具有較好作用。

Alpha 多樣性分析結果顯示，在本試驗條件下，3 個試驗藥物使用后的OUT 數量分別為54.33、50.33 和33.67， 顯著高于空白對照組的25.67， 表明用藥后雞腸道菌群結構均發生了顯著改變；Shannon 指數表明各藥物試驗組的腸道微生物多樣性高于試驗對照組（Simpson 值越低表示菌落多樣性越高）；但從ACE 值顯示，“球蟲血痢散”、“腸桿靈散”獸用中草藥試驗組的ACE值分別為60.09 和58.48， 顯著高于硫酸安普霉素試驗組（47.18）。 由此表明，2 個獸用中草藥制劑使用對調整雞腸道菌群結構和多樣性維持影響要顯著優于硫酸安普霉素抗生素， 為2 個獸用中草藥制劑的藥物作用機理提供了重要的科學理論依據。

目前，隨著我國養雞產業的規模化發展和數量的不斷增大，因養殖環境局部污染、飼養管理不當和營養因素導致雞大腸桿菌病原發、 繼發及混合感染呈上升態勢， 加大了疾病防控的難度和藥物防治成本。 同時，隨著雞腸道抗菌類化學藥物、抗生素藥物的廣泛使用，細菌耐藥性日益增強， 進一步加大了藥物的使用量和增加了藥物使用種類，并間接增加了藥物的殘留，形成了 “耐藥性—加大用藥量—殘留增加—加大耐藥性產生”的惡性循環。自國家衛生計劃委等14部門聯合制定的 《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016—2020 年）》 和農業農村部公布了2018—2021 年開展獸用抗菌藥減量計劃行動試點工作的通知以來，在飼料端禁抗、養殖端減抗和限抗大趨勢下，尋求切實有效、可廣泛應用的化學藥物、抗生素替代方案勢在必行。 目前市場上抗生素替代品種類繁多，如微生態制劑、抗菌肽、有機酸、多糖、植物提取物、植物精油、中草藥、新型酶制劑等， 其中獸用中草藥防治技術是我國目前畜禽養殖減抗、替抗的一個重要發展方向。試驗用“球蟲血痢散”和“腸桿靈散” 獸用中草藥制劑是針對養雞生產上大腸桿菌原發和球蟲病大腸桿菌繼發感染現象， 按照傳統中獸醫“君、臣、佐、使”組方原則進行藥物組方，對雞大腸桿菌感染疾病均有顯著防治作用， 本試驗應用Miseq 高通量檢測技術從雞腸道菌群門和屬水平上進一步分析和驗證了其藥物的有效性及功能優勢， 對今后獸用中草藥制劑的研發和技術集成創新研究具有良好的指導意義。