植物乳桿菌防治雞白痢沙門菌感染的效果評價

呂文亮， 張甜甜， 林顯華， 鹿 瑤， 徐海燕， 谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司/山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東泰安271000）

雞白痢是一種常見的禽類疾病，不同品種雞都易感，2 ~ 3 周齡發病率和死亡率最高，嚴重時病死率可達100%（孟繁新，2020），給養雞業帶來嚴重的損失。以前使用抗生素是臨床常見的預防和治療白痢沙門菌感染的方法，然而，這也同時造成了越來越嚴重的沙門菌耐藥性。 自從2020年7 月1 日我國飼料施行全面禁抗以來，畜禽養殖面臨著巨大地挑戰，人們迫切需要安全、綠色、有效的產品替代抗生素。 研究證實，益生菌是對宿主健康發揮有益作用的微生物，可有效抑制家禽腸道病原菌，提高生長性能，調節腸道菌群，刺激機體免疫功能（閆一博等，2021；于明等，2021；蔣磊等，2019；Jae 等，2013；Akira 等，1990）。許多報道證實乳桿菌對雞白痢沙門菌具有很好的作用。 羅伊氏乳桿菌ATCC 55730 可顯著提高沙門菌誘導的雛雞雞白痢疾病模型的存活率（Zhang等，2012）；干酪乳桿菌DBN023 可減少雞白痢沙門菌CMCC-533 對腸道的損傷， 保護腸道組織（Wang 等，2019）。 已有研究表明， 乳桿菌LB-9703 制劑治療雞白痢沙門菌的效果與抗生素功效相同， 可用于替代抗生素治療雞白痢沙門菌（ 郭 延 軍，2001）。 植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus plantarum） 是目前報道較多的對沙門菌屬（Salmonella spp.）有拮抗作用的益生菌物種之一（Sofyan 等，2019；Varmuzova 等，2016；Yin 等，2015）。 本研究選用植物乳桿菌BLCC2-0410（以下稱植物乳桿菌0410），應用人工感染雞白痢沙門菌的雛雞，研究其對雛雞死亡率、臟器沙門菌載菌量、腸道乳酸菌數量、血液生化指標、免疫球蛋白和炎癥因子的影響， 來評估該植物乳桿菌BLCC2-0410 對雛雞沙門菌感染的防治效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 益生菌株 植物乳桿菌0410 （BLCC2-0410）， 由山東寶來利來生物工程股份有限公司，生物工程研究院菌種資源保藏中心提供。

1.1.2 攻毒菌株 雞白痢沙門菌CVCC533，購買自中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 主要試劑與儀器 MRS 培養基，按質量百分數計， 葡萄糖2.0%、 檸檬酸銨0.2%、 乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、吐溫－80 0.1%，pH 6.0， 固體培養基需要加1.5%瓊脂粉。 LBS 瓊脂培養基、SS 瓊脂培養基，購自青島海博生物技術有限公司。 免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白IgM、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。 Thermo 酶標儀，購自賽默飛世爾上海儀器有限公司。DHP－9082 電熱恒溫培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司。 全自動生化分析儀（KHB卓越330），購自科華生物。

1.2 試驗設計 1 日齡健康海蘭褐雛雞120 只，購自泰安東岳種禽有限公司。 經腸道菌群和平板凝集試驗檢測，雛雞未攜帶雞白痢沙門菌。逐只稱重，按體重平均分配到12 組中，10 只/組，每組雛雞的平均體重基本一致， 設置空白對照組（CK組）、感染組（S 組）、益生菌組（R 組）3 個處理組，每個處理組4 個重復。

1.2.1 益生菌制劑的飼喂 自1 日齡開始飼喂雛雞益生菌制劑，采用自由飲用的方式，每只雞平均飲用2 mL/d，0 ~ 3 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×1010cfu/mL，4 ~ 7 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×109cfu/mL，8 ~ 10 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×108cfu/mL。

1.2.2 攻菌菌液制備 將雞白痢沙門菌CVCC533 接種到TSB 培養基中，37 ℃，180 r/min，培養24 h， 將菌液轉至無菌離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌泥，用無菌生理鹽水重懸，制成4.0×109cfu/mL 濃度的攻毒菌液。

1.2.3 人工感染試驗 3 日齡開始進行雞白痢沙門菌感染， 經口灌喂上述雞白痢沙門菌菌液，0.5 mL/只，共進行兩次。 第1 次攻菌前停飼16 h，斷水0.5 h，攻菌后0.5 h 恢復飲食飲水；第2 次攻菌前0.5 h 停飼停水，攻菌后0.5 h 恢復飲食飲水。 2 次攻菌在24 h 內完成。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 死亡率 從試驗開始到試驗結束， 每天統計雛雞死亡只數，最后計算雛雞死亡率。

1.3.2 臟器沙門菌載菌量 試驗結束后， 每處理組取3 只未死亡雛雞，心臟采血后處死，無菌取肝臟、脾臟和腎臟，分別制備成10%（m/m）的組織勻漿液，經10 倍倍比稀釋，通過平板計數法測定臟器沙門菌載菌量。

1.3.3 腸道乳酸菌數量 取0.5 g 腸道內容物溶于4.5 mL 生理鹽水中進行10 倍倍比稀釋， 選擇合適的稀釋梯度進行菌群數量測定。 使用平板計數法測定腸道內容物中乳酸菌數量。

1.3.4 血清免疫指標 試驗結束后， 每處理組取3 只未死亡雛雞，心臟采血，分離血清。 按試劑盒說明書進行IgA、IgM、IgG 的測定。

1.3.5 血清炎癥因子檢測 按試劑盒說明書進行IL-1β、IFN-γ 及TNF-α 的測定

1.3.6 血液生化指標 用全自動生化分析儀 （卓越330）檢測血清球蛋白、白蛋白、總蛋白及谷草轉氨酶含量。

1.4 數據統計與分析 數據用Excel 2010 初步整理， 使用SPSS 13.0 進行單因素方差（ANOVA）分析，組間數據用Duncan's 法進行多重比較，結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 益生菌制劑對雛雞死亡率的影響 由表1可知， 感染組和益生菌組雛雞發病死亡率分別為82.5%、32.5%， 植物乳桿菌可降低雛雞相對死亡率，較感染組降低60.6%，飼喂植物乳桿菌0410可有效的降低雞白痢沙門菌感染雛雞死亡率。

表1 各組雛雞死亡率

2.2 臟器沙門菌載菌量 由表2 可知， 感染組（S）雛雞肝臟、脾臟和腎臟上都檢測到沙門菌，而益生菌組和空白對照組未檢測到沙門菌。 從沙門菌檢測結果來看， 應用植物乳桿菌后可有效防止雞白痢沙門菌在機體內的侵染。

表2 臟器沙門菌數量cfu/g（×102）

2.3 腸道乳酸菌數量 從表3 可以看出，益生菌組雛雞腸道乳酸菌數量較空白對照組和感染組分別提高3.32 倍和11.12 倍（P＜0.05），感染組雛雞腸道中乳酸菌數量最少， 說明飼喂植物乳桿菌可增加攻毒后雛雞腸道內乳酸菌數量。

表3 腸道乳酸菌數量cfu/g（×102）

2.4 免疫球蛋白 如表4 所示，雛雞飼喂植物乳桿菌0410 后血清中IgG 含量增加，分別較感染組和空白對照組提高6.69%和2.03%； 血清中IgM含量較感染組降低14.63%（P＜0.05）， 較空白對照組降低0.64%（P＞0.05）；益生菌組血清中IgA含量較空白對照組提高7.08%（P＜0.05），較感染組降低4.42%（P＞0.05）。

表4 雛雞血清中免疫球蛋白分析μg/mL

2.5 炎癥因子 如表5 所示， 益生菌組血清中IFN-γ 含量較感染組升高3.94%（P＞0.05），TNFα 含量較感染組升高3.37%（P＞0.05），益生菌組血清中IL-1β 的含量較感染組降低11.29%（P＜0.05）。 益生菌組血清中IL-1β、IFN-γ 和TNF-α含量較空白對照組分別升高7.29%、11.21%（P＜0.05）和6.96%（P＞0.05）。

表5 雛雞血清中炎癥因子分析pg/mL

2.6 生化指標檢測 從表6 中可以看出，益生菌組谷草轉氨酶 （AST） 濃度較于感染組降低36.06%（P＜0.05），益生菌組白蛋白、球蛋白和總蛋白濃度較感染組分別提高22.75%、27.91%和24.29%（P＞0.05）。 感染雞白痢沙門菌后AST 濃度增高， 而飼喂益生菌可使其濃度降到與空白對照組幾乎相同的水平。 飼喂益生菌后可以提高感染雛雞的蛋白水平， 而幾種蛋白可以反映機體的抵抗力。 表明飼喂益生菌可以提高感染雛雞的抗病力。

表6 生化指標檢測

3 討論

近年來的研究發現， 用益生菌制劑預防雞白痢沙門菌有較好的效果。 用屎腸球菌J96 對肉雞進行預處理， 可將雞白痢沙門菌引起的死亡率從50%降低到25%（Carina 等，2000）。 感染雞白痢沙門菌前飼喂干酪乳桿菌DBN023 可將雛雞死亡率由24%將至8%（（Wang 等，2019））。 根據乳酸桿菌表現出的許多關鍵特性， 如對酸和膽汁的高耐受性、黏附腸道表面的能力、耐低pH、胃液（抗菌活性）、 抗抗生素、 產生胞外多糖和去除膽固醇（Ruiz 等，2013；Tulumoglu 等，2013）等，其對雞白痢沙門菌應具有較好效果。 植物乳桿菌BLCC2-0410 和雞白痢沙門氏菌CVCC533 共培養24 h的體外試驗研究發現， 雞白痢沙門菌數量降低了約3 個對數值（張甜甜等，2021）。 乳酸桿菌KL1和植物乳桿菌Zhang-LL 混合益生菌有效地降低了雞白痢的死亡率（Chen 等，2020）。 本研究結果表明， 使用植物乳桿菌BLCC2-0410 后可降低雛雞相對死亡率達到60.6%。

因益生菌對宿主健康的益生特性， 現在已經廣泛用于防治動物疾病。乳酸菌具有的耐酸、耐膽鹽特性， 可以使其在家禽胃腸道內發揮很好的作用。 如乳酸菌可以競爭性消除沙門菌在腸上皮細胞定植 （Salehizadeh 等，2020；Thirabunyanon 等，2012），保護腸道組織結構完整性，防止細菌移位而減少臟器的載菌量。本試驗結果表明，飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 可降低雛雞臟器載菌量，這與一些研究的結果一致。 有研究證明， 在雞感染模型中，乳酸菌混菌處理后肝臟、脾臟中沙門菌載量降低（Yang 等，2014）。也有研究發現，植物乳桿菌WLPL01 艾草發酵液，能減少肝臟、脾臟中鼠傷寒沙門菌的數量（詹暉等，2019）。

益生菌的作用可以通過免疫系統相關基因的表達，如細胞因子表達來介導。細胞因子在宿主防御、 炎癥反應和免疫介導的疾病等方面起重要作用。 TNF-α 是一種多功能細胞因子，在調節免疫反應和急性期反應時起著非常重要的作用（Akira等，1990）。IFN-γ 是細胞免疫的一個常見標志物，其含量高低與腸道感染的保護性免疫應答相關（Lee 等，2008）。 腫瘤壞死因子超家族的成員在先天免疫和適應性免疫，包括炎癥、凋亡和細胞增殖中起著至關重要的作用（Kaiser 等，2014）。使用益生菌可以調節雞沙門菌介導的細胞因子， 包括促炎細胞因子、T 輔助 （Th）1 細胞因子和Th2 細胞因子。 將三周齡雞的微生物群轉移至一日齡雛雞的胃腸道可刺激細胞因子如IL1β、IL8、IL17、IL22和IL18 的表達（Varmuzova 等，2016）。 本試驗中，飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 后感染白痢沙門菌雛雞血清中炎癥因子TNF-α 和IFN-γ 含量升高，而血清中炎癥因子IL-1β 含量降低，這可能與飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 會影響感染雛雞炎癥反應有關。

在臨床實踐中， 通常通過測定血清免疫球蛋白含量評價機體免疫水平。 受感染的雞可以產生三 種 主 要 的 抗 體：IgG、IgA 和IgM （Ayaz 等，2008）。本研究感染組血清中IgA 濃度高于益生菌組，這與Park 等（2017）研究結果飼糧中加入枯草芽孢桿菌（T1，T2)免疫球蛋白IgA 濃度顯著提高（P< 0.05）不一致，可能與所使用菌株不同，益生菌可以減緩雞白痢沙門菌感染后免疫球蛋白IgA的升高有關。有研究證明，乳酸菌制劑提高了鼠傷寒沙門菌感染肉仔雞血清中IgG 和sIgA 含量（鄭江平等，2020）。 本試驗中植物乳桿菌BLCC2-0410 可提高感染白痢沙門菌雛雞血清中IgG 含量與上述研究結果一致， 提示飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 可提高感染雛雞的免疫功能。

血液生化指標可以反映動物機體內部代謝水平和健康狀況，球蛋白（GLB）可以增強機體免疫力，白蛋白（ALB）可以維持血液膠體滲透壓（孟競堯等，2021）。 谷草轉氨酶（AST）是評定動物肝臟功能的重要指標， 通常肝細胞受損會導致血液中轉氨酶質量分數的升高（許金根等，2020）。益生菌可以顯著影響動物血液生化指標。 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可顯著影響不同天數斷奶山羊球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、谷草轉氨酶（AST）及總蛋白 （TP） 等生化指標， 其中第30 天血清中AST 含量顯著降低（盧佳偉等，2021）。本試驗飼喂植物乳桿菌可使AST 含量顯著降低，基本恢復到與空白對照組相當水平， 可有效防止雞白痢沙門菌對肝臟的侵染。 同時有研究發現， 日糧中添加0.2%乳桿菌或酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌的復合微生物制劑均可提高血清中總蛋白水平（劉乃芝等，2012；趙建文，2011；劉淑嬌等，2019）。 在本試驗中使用植物乳桿菌BLCC2-0410 后可增加感染白痢沙門菌雛雞血清中ALB、GLB 和TP 含量，有效提高了機體對雞白痢沙門菌抵抗力。結果說明，植物乳桿菌BLCC2-0410 可降低白痢沙門菌對肝臟的損傷，提高雛雞抗病能力，有效防治雞白痢沙門菌感染。

4 結論

通過雞白痢沙門菌感染試驗和飼喂植物乳桿菌0410（BLCC2-0410）的效果評價，飼喂植物乳桿菌0410（BLCC2-0410）對防治雞白痢沙門菌感染具有較好的作用。