白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西門塔爾雜交牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系的影響

劉 垚， 姜 菲， 彭忠利， 吳華卓， 游茵潔， 王晨曦

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

瘤胃是反芻動(dòng)物重要的器官， 其具有強(qiáng)大的降解纖維物質(zhì)的能力， 這種能力依賴于其中共生的各種瘤胃微生物（Roderick-I，2002），包括細(xì)菌、原蟲、古細(xì)菌及真菌，這些微生物種群的活動(dòng)對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收和能量代謝起到極其重要的作用（Xu 等，2015）。動(dòng)物的年齡、飼糧結(jié)構(gòu)和健康狀況等均會(huì)影響瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系（Carberry等，2012），其中飼糧結(jié)構(gòu)是最主要的因素。目前反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中普遍持有的觀點(diǎn)是瘤胃微生物高度適應(yīng)不同的飼糧結(jié)構(gòu) （Pitta 等，2014；Mullins等，2013）。 目前將白酒糟作為飼料利用的主要方式有鮮酒糟直接飼用、 烘干飼用及微生物發(fā)酵后飼用等方式， 而鮮酒糟直接飼用有水分大、 酸度高、極易腐敗變質(zhì)等諸多不足（劉志云等，2020）。與玉米相比，白酒糟中粗蛋白質(zhì)含量較高，淀粉含量較少，含有大量稻殼，導(dǎo)致其纖維含量高，影響其利用效率（楊艷紅，2016）。通過微生物發(fā)酵可有效改善酒糟的營(yíng)養(yǎng)特性， 微生物能夠?qū)⒕圃阒械睦w維素等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸， 并可產(chǎn)生各種生物酶， 進(jìn)而提高利用效率 （宋善丹等，2015；Lumpkins 等，2005）。 研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊飼糧中添加酒糟對(duì)胴體品質(zhì)和生長(zhǎng)性能沒有影響， 但可提高瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的含量（Crane 等，2017）。飼喂干酒糟能提高公牛的生長(zhǎng)性能及肉品質(zhì)（Viviane 等，2020）。

在我國(guó)，西門塔爾雜交牛（西門塔爾牛×本地黃牛，以下簡(jiǎn)稱西雜牛）是主要的肉牛養(yǎng)殖品種之一， 白酒糟作為飼料原料在西雜牛生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。 本試驗(yàn)擬采用白酒糟和發(fā)酵酒糟替代部分牧草，飼喂育肥肉牛，進(jìn)而探索不同處理方式的白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物多樣性的影響， 以期為酒糟飼料的合理開發(fā)和高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 本試驗(yàn)在四川省宜賓市長(zhǎng)寧縣九牛肉牛養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)開始前，做好圈舍清潔和消毒等準(zhǔn)備工作， 對(duì)所有牛免疫驅(qū)蟲。牛只分欄拴系飼養(yǎng)，正試期以預(yù)飼期采食量為參考投喂全混合日糧， 每日飼喂2 次 （7:00 和16:00），牛只均自由采食和飲水，飼養(yǎng)期間保持圈舍整潔通風(fēng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取49 頭體重相近[（491.35±48.32）kg]、 健康狀況良好的西門塔爾雜交公牛進(jìn)行育肥試驗(yàn)， 在其飼糧中以粗料的形式分別用一定量的白酒糟和發(fā)酵酒糟替換等量皇竹草（干物質(zhì)基礎(chǔ)），按照體重相近的原則隨機(jī)分為七個(gè)處理組，分別為試驗(yàn)1 組（對(duì)照組0%）、試驗(yàn)2 組（20%白酒糟）、試驗(yàn)3 組（40%白酒糟）、試驗(yàn)4 組（60%白酒糟）、試驗(yàn)5 組（20%發(fā)酵白酒糟）、試驗(yàn)6 組（40%發(fā)酵白酒糟） 和試驗(yàn)7 組 （60%發(fā)酵白酒糟），每個(gè)處理7 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭牛。預(yù)飼期15 d，正飼期60 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧 試驗(yàn)飼糧由精料（玉米、濃縮料）和粗料（皇竹草、白酒糟、發(fā)酵白酒糟）組成，白酒糟和發(fā)酵白酒糟飼糧分別是以20%、40%和60%白酒糟或發(fā)酵白酒糟替換基礎(chǔ)飼糧中等量皇竹草配制的全混合日糧， 各處理組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）見表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 瘤胃液的采集 試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天晨飼前，采用口腔導(dǎo)管采集瘤胃液，棄去最初的50 mL（避免唾液的影響）， 瘤胃液采集后使用PHB-5 型便攜式pH 計(jì)立即測(cè)定pH，然后分裝于15 mL 離心管和5 mL 凍存管中，15 mL 離心管-20 ℃保存，用于氨態(tài)氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定；5 mL 凍存管立即投入液氮中保存，用于細(xì)菌菌群多樣性的測(cè)定。

1.4.2 指標(biāo)的測(cè)定 飼糧中干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、粗灰分（Ash）、鈣（Ca）和磷（P）參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法進(jìn)行，中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）的含量參照Van Soest 等（1991）方法進(jìn)行測(cè)定。NH3-N 參照比色法（馮宗慈等，2010）測(cè)定。 MCP 參照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定（Bradford，1976）。VFA 用Agilent 6890N 氣相色譜儀測(cè)定。

1.4.3 瘤胃細(xì)菌多樣性 根據(jù)OMEGA-soil DNA試劑盒（USA）說明書進(jìn)行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳提取得到的DNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；然后用338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對(duì)V3 ~ V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）， 最后72 ℃延伸10 min （PCR 儀：ABI GeneAmpR9700 型）。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL2.5mM dNTPs，0.8 μL 引物 （5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA 模板。

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物， 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行定量檢測(cè)。 然后用純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建Miseq PE 2×300 的文庫， 采用Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接， 使用的UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類， 并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。 利用RDP classifier （http://rdp.cme.msu.edu/） 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU128），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)通過Excel 2010 整理后，再使用SPSS 20.0 進(jìn)行雙因素方差分析， 采用Duncan's 法多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P< 0.05 表示差異顯著，P> 0.05 表示差異不顯著，0.05

2 結(jié)果與討論

2.1 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.1.1 白酒糟與發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵VFA 組成的影響 由表2 可知， 酒糟類型對(duì)丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量均有顯著影響（P< 0.05），對(duì)乙酸、戊酸含量以及乙丙比無顯著影響（P> 0.05），其中白酒糟組的丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量均顯著低于發(fā)酵白酒糟組（P< 0.05）。 飼糧中酒糟替代水平對(duì)乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸含量以及乙丙比均有顯著影響（P<0.05），其中以替代20%酒糟組乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量最高，顯著高于對(duì)照組和替代60%組（P< 0.05），與替代40%組無顯著差異（P> 0.05）；對(duì)照組異丁酸和異戊酸含量顯著低于替代20%、40%和60%酒糟組（P< 0.05）且替代水平間無顯著差異（P> 0.05）；丙酸以替代20%酒糟組含量最高， 顯著高于替代40%和60%酒糟組 （P<0.05），與對(duì)照組無顯著差異（P> 0.05）；乙丙比以替代60%組含量最高， 顯著高于對(duì)照組和替代20%組（P< 0.05），與替代40%組無顯著差異（P>0.05）。 酒糟類型和酒糟替代水平對(duì)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸、揮發(fā)性脂肪酸及乙丙比均無顯著的互作效應(yīng)（P> 0.05）。

表2 白酒糟與發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃VFA 組成的影響

2.1.2 白酒糟與發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N 及MCP 的影響 由表3 可知，酒糟類型對(duì)pH、 氨態(tài)氮及微生物蛋白均有顯著影響 （P<0.05），其中白酒糟替代組pH 和氨態(tài)氮均顯著高于發(fā)酵白酒糟組（P< 0.05），但發(fā)酵白酒糟組微生物蛋白顯著高于白酒糟組（P<0.05）。 酒糟添加水平對(duì)pH、 氨態(tài)氮及微生物蛋白均有顯著影響 （P<0.05），其中對(duì)照組的氨態(tài)氮含量顯著高于酒糟替代組（P< 0.05），同時(shí)隨著酒糟替代量的升高顯著降低（P<0.05）；對(duì)照組MCP 含量顯著低于酒糟替代組（P< 0.05），同時(shí)隨著酒糟替代量的升高顯著提高（P<0.05）；而pH 則以酒糟60%替代組最高，顯著高于對(duì)照組、酒糟20%和40%替代組（P<0.05），其中以酒糟20%替代組最低，均顯著低于對(duì)照組和酒糟40%替代組，而對(duì)照組和酒糟40%替代組無顯著差異（P>0.05）。 酒糟類型和酒糟添加水平對(duì)微生物蛋白（MCP）含量有顯著的互作效應(yīng)（P<0.05）。

表3 白酒糟與發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N 及MCP 的影響

2.2 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.2.1 測(cè)序基本信息 如表4 所示， 通過Miseq測(cè)序，28 個(gè)瘤胃液樣本共獲得1788887 條優(yōu)化序列，每個(gè)樣本平均產(chǎn)生63889 條，序列平均長(zhǎng)度為419.52 bp。

表4 樣本測(cè)序基本信息

2.2.2 Alpha 多樣性分析 如表5 所示， 七個(gè)處理組樣本覆蓋率達(dá)到98.9%以上， 說明測(cè)序深度高， 足以反映瘤胃菌群的豐富度及多樣性，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映物種多樣性，Shannon 指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小， 說明群落多樣性越高，Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)可反映瘤胃菌群的豐度，由表可知，酒糟類型及替代水平對(duì)微生物多樣性及豐度無顯著影響且酒糟類型與酒糟添加量之間不存在交互作用（P> 0.05）。

表5 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃細(xì)菌群落Alpha 多樣性的影響

稀釋曲線可以反映出各個(gè)處理組在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性， 曲線的趨勢(shì)是否平坦可說明樣本的測(cè)序數(shù)量是否合理。由圖1 可得，各個(gè)處理組測(cè)序量在20000 條以上時(shí)， 物種數(shù)量逐漸趨于飽和，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量逐漸接近最高值，反映出測(cè)序數(shù)據(jù)的合理及物種多樣性信息具有代表性。多樣性指數(shù)曲線可反映瘤胃細(xì)菌多樣性，七個(gè)處理組曲線均趨于平坦， 其中試驗(yàn)5 組瘤胃細(xì)菌多樣性最低，試驗(yàn)6 組最高，其余從高到低依次為試驗(yàn)7 組、3 組、1 組、4 組、2 組。 對(duì)照1 組和試驗(yàn)2、3、4 組群落多樣性相差不大且略低于試驗(yàn)6 組和7 組。

圖1 瘤胃細(xì)菌稀釋性曲線（left）和多樣性指數(shù)曲線（right）圖

Rank-Abundance 分析可比較瘤胃細(xì)菌群落豐度和均勻度在飼糧中白酒糟和發(fā)酵白酒糟不同添加量下的差異。由圖2 可知，對(duì)照組在圖中橫軸上的曲線長(zhǎng)度最長(zhǎng)，表明其物種豐度最高，然后依次是試驗(yàn)4 組、試驗(yàn)6 組、試驗(yàn)7 組、試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組、 試驗(yàn)5 組。 且各個(gè)處理組曲線均逐漸平直，說明七個(gè)處理組物種組成均勻度都較高。

圖2 瘤胃細(xì)菌Rank-Abundance 分析圖

2.2.3 瘤胃微生物菌群分析 瘤胃細(xì)菌OTU 分布的Venn 圖可以反映各處理組中瘤胃細(xì)菌多樣性相似程度。由圖3 可知，試驗(yàn)1 組到7 組瘤胃中OTUs 總 數(shù) 分 別 為2021、1985、2000、1929、1887、1957、1896，相同用量下，白酒糟各組多樣性均高于發(fā)酵白酒糟； 各組共有OTUs 數(shù)為1142， 獨(dú)有OTUs 數(shù)分別為79、30、26、12、20、23、28， 占各自O(shè)TUs 總 數(shù) 的 3.91% 、1.51% 、1.30% 、0.62% 、1.06%、1.18%、1.48%。

圖3 瘤胃細(xì)菌OTU 分布的Venn 圖

美吉生物云交互分析結(jié)果顯示， 經(jīng)過序列對(duì)比和注釋，28 個(gè)樣本中共有2666 個(gè)OTU，從物種分類水平上分為21 個(gè)門，41 個(gè)綱，87 個(gè)目，156個(gè)科，390 個(gè)屬，743 個(gè)種。由表6 可知，門水平上，七個(gè)處理組瘤胃微生物物種組成的相對(duì)豐度較高的門有6 個(gè)，分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和纖維桿菌門Fibrobacteres（Fibrobacteres）。 其中對(duì)照組相對(duì)豐度前6 的有Bacteroidetes、Firmicytes、Spirochaetae、Proteobacteria、Actinobacteria、Fibrobacteres，分別占瘤胃細(xì)菌的64.33%、27.71%、2.38%、1.13%、0.74%和1.32%， 試驗(yàn)2、3、4、5、6、7組的Bacteroidetes 分別占瘤胃細(xì)菌的64.53%、58.56%、64.73%、69.17%、65.03%和61.62%，F(xiàn)irmicutes 分別占瘤胃細(xì)菌的25.65%、32.69%、29.38%、25.35%、27.45%、30.23%，Spirochaetae 分別占瘤胃細(xì)菌的1.78%、1.44%、1.38%、1.02%、2.47%、1.98%，Proteobacteria 分別占瘤胃細(xì)菌的1.11%、1.11%、1.13%、1.66%、1.58%、2.00%，Actinobacteria 分別占瘤胃細(xì)菌的2.64%、3.25%、0.86%、0.45%、0.89%、0.67%，F(xiàn)ibrobacteres 分別占瘤胃細(xì)菌的2.81%、0.95%、0.54%、0.43%、0.73%、1.07%。

表6 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃細(xì)菌豐度的影響（門水平）%

門水平差異性統(tǒng)計(jì)分析顯示，西雜牛瘤胃主要優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes） 和厚壁菌門（Firmicutes）， 試驗(yàn)各組擬桿菌門和厚壁菌門差異都不顯著（P> 0.05），其余4 種相對(duì)占比較大的門中僅放線菌門（Actinobacteria） 豐度有差異（P<0.05）， 白酒糟替代組中放線菌門豐度顯著高于發(fā)酵白酒糟組（P<0.05）。此外，隨著白酒糟用量的升高，白酒糟各處理組中螺旋菌門（Spirochaetae）和纖維菌門（Fibrobacteres）豐度逐漸降低；隨著發(fā)酵白酒糟用量的升高，發(fā)酵白酒糟各處理組中纖維菌門豐度逐漸升高，但各組差異均不顯著（P>0.05）。

從屬水平對(duì)七個(gè)處理組的瘤胃微生物物種組成相對(duì)豐度分析（表7），結(jié)果表明，七個(gè)處理組中相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 以上的屬中，含量最高的是普雷沃氏菌屬1（Prevotella 1），其次是擬桿菌屬BS11 （Bacteroidales BS11 gut group）， 理研菌屬RC9 （Rikenellaceae RC9 gut group）， 普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae UCG-003）， 擬桿菌屬RF16 （Bacteroidales RF16 group）， 擬 桿 菌 屬S24-7 （Bacteroidales S24-7 group），瘤胃球菌屬2（Ruminococcus 2），疣微菌科NK4A214（Ruminococcaceae NK4A214 group）。對(duì)照組（1 組）瘤胃菌屬相對(duì)豐度在1.5%左右且含 量 在 前8 的 屬 中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG-003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24 -7 group、Ruminococcus 2 和Ruminococcaceae NK4A214 分別占瘤胃細(xì)菌的24.43% 、13.89% 、8.49% 、6.30% 、2.17% 、1.79% 、1.60%和1.87%。試驗(yàn)2 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 的屬中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG -003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24 -7 group、Ruminococcus 2 和Ruminococcaceae NK4A214 分 別占瘤胃細(xì)菌的25.81%、11.51%、6.77%、4.83%、3.14%、4.52%、2.36%和1.59%。 試驗(yàn)3 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 的屬中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG-003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcus 2 和 Ruminococcaceae NK4A214 分別占瘤胃細(xì)菌的30.56%、5.80%、6.49%、2.79%、2.70%、3.63%、3.57%和2.35%。 試驗(yàn)4 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在 前8 的 屬 中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG-003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcus 2 和Ruminococcaceae NK4A214 分別占瘤胃細(xì)菌的20.53% 、17.32% 、7.25% 、2.73% 、6.13% 、2.47% 、2.95%和2.03%。試驗(yàn)5 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 的屬中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG -003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24 -7 group、Ruminococcus 2 和Ruminococcaceae NK4A214 分 別占瘤胃細(xì)菌的22.17%、21.25%、6.09%、3.78%、6.08%、3.18%、2.77%和1.55%。 試驗(yàn)6 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 的屬中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG-003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcus 2 和 Ruminococcaceae NK4A214 分別占瘤胃細(xì)菌的26.32%、8.19%、6.99%、5.46%、4.05%、2.85%、3.05%和2.33%。 試驗(yàn)7 組瘤胃菌屬相對(duì)豐度約在1.5%左右且含量在前8 的 屬 中，Prevotella 1、Bacteroidales BS11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group、Prevotellaceae UCG-003、Bacteroidales RF16 group、Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcus 2 和Ruminococcaceae NK4A214 分別占瘤胃細(xì)菌的29.92%、4.34%、4.54%、3.19%、4.21%、2.91%、3.40%和1.99%。

表7 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃細(xì)菌豐度的影響（屬水平）%

屬水平差異性統(tǒng)計(jì)分析顯示， 各處理組豐度大于1.5%的8 中菌屬中， 是瘤胃主要的優(yōu)勢(shì)均屬，各處理組普雷沃氏菌屬（Prevotella 1）均無顯著差異（P> 0.05）；隨著發(fā)酵白酒糟用量的增加，40%替代組和60%替代組中擬桿菌屬BS11（Bacteroidales_BS11_gut_group） 豐度較20%替代組顯著降低；白酒糟60%替代組擬桿菌科RF16（Bacteroidales RF16 group） 豐度較其他組顯著提高（P< 0.05）， 而發(fā)酵白酒糟20%替代組擬桿菌科RF16 豐度顯著高于對(duì)照組（P< 0.05）；隨著替代比例的增加，40%和60%發(fā)酵白酒糟替代組較對(duì)照組瘤胃球菌屬2（Ruminococcus_2）豐度顯著升高（P< 0.05）。各處理組其他幾種菌屬豐度差異不顯著（P> 0.05）。

Beta 多樣性分析通過對(duì)不同生境或微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性，其中主坐標(biāo)分析（PCoA）圖中樣本之間的距離代表兩者的相似度，距離越近則相似度越高。從圖4 可以看出，本試驗(yàn)中試驗(yàn)5 組兩個(gè)重復(fù)偏離較遠(yuǎn)，其他樣本點(diǎn)出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，說明相似度水平較高。

圖4 瘤胃微生物主坐標(biāo)分析

3 討論

3.1 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA 可為機(jī)體提供70% ~ 80%的能量，同時(shí)也可為瘤胃微生物的增殖提供碳架 （王玲，2016；Spears 等，2004）， 其中乙酸、 丙酸和丁酸含量占TVFA 的95%左右， 丙酸可作為糖異生的原料合成葡萄糖為機(jī)體提供能量（丁健，2013），進(jìn)而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能及飼料利用率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵白酒糟組丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸及TVFA 含量顯著高于白酒糟組， 同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加發(fā)酵酒糟相比添加干酒糟更能提高瘤胃中丙酸、丁酸和TVFA 的含量（汪成等，2021），與本研究結(jié)果相近， 可能是由于發(fā)酵酒糟中纖維含量較低，同時(shí)含有多種有益微生物和生長(zhǎng)促進(jìn)因子，有利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用效率，說明飼料中添加發(fā)酵酒糟可為機(jī)體提供更多的可消化能。 從酒糟添加水平上，本研究發(fā)現(xiàn)20%的酒糟添加量更有利于乙酸、 丙酸和TVFA 的生成，而60%的添加量顯著降低了三者的含量，說明添加過高的酒糟不利于瘤胃VFA 生成。

瘤胃pH 是反映反芻動(dòng)物瘤胃生理狀況的重要指標(biāo)也是瘤胃生理狀況的最直接表現(xiàn)， 對(duì)瘤胃功能、 瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物及瘤胃微生物區(qū)系等有重要影響（Nagaraja 等，2007）。 pH 的大小主要取決于瘤胃VFA、乳酸等有機(jī)酸的含量。 pH 過低，就會(huì)引起反芻動(dòng)物瘤胃酸中毒， 過高就會(huì)影響反芻動(dòng)物瘤胃VFA 的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體供能不足。 有研究表明，當(dāng)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵pH 低于6.1 時(shí)，瘤胃內(nèi)纖維素降解菌活動(dòng)就會(huì)因?yàn)樗岫冗^高而受到抑制，當(dāng)pH 低于5.9 時(shí)停止活動(dòng)（Miwa 等，1997）。另有研究報(bào)道，瘤胃發(fā)酵正常pH 為6 ~ 7（James等，1997）。 本試驗(yàn)中，各處理組的瘤胃發(fā)酵pH 均在正常范圍內(nèi)， 說明在本試驗(yàn)條件下添加白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)瘤胃pH 沒有造成不利影響。 pH的大小與飼料組成密切相關(guān)（Yang 等，2001）。 本研究發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵白酒糟組pH 顯著低于添加白酒糟組， 與前人研究結(jié)果相比干酒糟添加發(fā)酵酒糟顯著降低了瘤胃pH（汪成等，2021）相一致，可能與發(fā)酵酒糟在瘤胃中更容易產(chǎn)生有機(jī)酸有關(guān)，與本試驗(yàn)中瘤胃發(fā)酵VFA 的結(jié)果相吻合，但本研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)酒糟添加量為60%時(shí)，pH 顯著升高，具體原因有待進(jìn)一步探索。

氨態(tài)氮是瘤胃微生物利用飼料中的粗蛋白質(zhì)合成的，也是合成MCP 的原料，其含量可反映瘤胃微生物分解飼料中的含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3的速率及對(duì)NH3的利用情況（劉宗柱等，1998），研究表明， 瘤胃中NH3-N 的濃度正常范圍為6.3 ～27.5mg/10 mL（Illius，1989），如果NH3-N 濃度過低， 無法為瘤胃微生物合成MCP 提供充足的氮源，從而影響宿主的生產(chǎn)性能，若NH3-N 濃度過高， 表明微生物利用NH3-N 合成MCP 的速率低于微生物降解飼料中CP 和內(nèi)源氮生成NH3-N 的速率，從而造成氮的浪費(fèi)。本研究結(jié)果顯示各處理組NH3-N 濃度為11.09 ~ 12.78 mg/10 mL， 均在正常范圍，略高于汪成等（2021）和曹廣等（2020）在牦牛上的研究， 推測(cè)可能是本試驗(yàn)添加酒糟量與之相比較多，使飼料中CP 含量較高，經(jīng)微生物分解后未能及時(shí)用于合成MCP 所致。但本研究也發(fā)現(xiàn)白酒糟組NH3-N 濃度高于發(fā)酵白酒糟組，而發(fā)酵白酒糟組MCP 高于白酒糟組，可能是由于發(fā)酵白酒糟相比干酒糟蛋白質(zhì)組成較好且適口性較好，酒糟經(jīng)發(fā)酵處理后蛋白質(zhì)水平升高，利于微生物利用合成MCP。 同時(shí)在酒糟添加水平上發(fā)現(xiàn)，添加酒糟后NH3-N 濃度低于對(duì)照組，MCP 含量高于對(duì)照組，而曹廣等（2020）研究結(jié)果顯示在飼料中分別添加2.5%和5%發(fā)酵酒糟后，NH3-N 濃度和MCP 含量相比對(duì)照組無顯著變化，本試驗(yàn)分別以20%、40%和60%的添加量飼喂，兩者濃度差異較大，可能會(huì)引起不同的結(jié)果。

3.2 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

3.2.1 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃微生物多樣性的影響 測(cè)序深度和覆蓋度是評(píng)估測(cè)序結(jié)果的兩個(gè)方面，一般情況下兩者呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，Miseq 測(cè)序顯示28 個(gè)瘤胃液樣本共獲得1788887 條優(yōu)化序列， 每個(gè)樣本平均產(chǎn)生63889條， 序列平均長(zhǎng)度為419.52 bp， 試驗(yàn)各組共有1142 個(gè)OTUs， 其中白酒糟各組共有1501 個(gè)OTUs，發(fā)酵白酒糟各組共有1447 個(gè)OTUs，測(cè)序覆蓋率均在98.9%以上。Mao 等（2015）研究表明，覆蓋率大于97%則說明測(cè)序樣品充分，即本試驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果能覆蓋西雜牛瘤胃中大多數(shù)細(xì)菌群落，能真實(shí)地反映育肥西雜牛瘤胃中細(xì)菌的組成情況。白大洋（2019）試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)各組西雜牛共有1811 個(gè)OTUs， 本試驗(yàn)結(jié)果與其相比較高， 推測(cè)可能的原因與西雜牛年齡階段及飼養(yǎng)環(huán)境的不同有關(guān)。 反芻動(dòng)物瘤胃微生物多樣性是微生物與動(dòng)物本身共同進(jìn)化的結(jié)果， 由于宿主本身的種類差異、 不同年齡和生理階段其瘤胃微生物多 樣 性 也 會(huì) 有 所 不 同 （Jami 等，2013；Yasuo，2006），同時(shí)反芻動(dòng)物瘤胃微生物多樣性也受日糧結(jié)構(gòu)影響（馬健等，2019）。本試驗(yàn)西雜牛采用拴系飼養(yǎng)，其日糧結(jié)構(gòu)較為單一，可能會(huì)使得瘤胃微生物多樣性較低。

在本試驗(yàn)中， 西雜牛瘤胃細(xì)菌多樣性和物種群落豐度檢測(cè)結(jié)果顯示， 七個(gè)處理組瘤胃細(xì)菌多樣性從高到低依次為: 試驗(yàn)6 組>試驗(yàn)7 組>試驗(yàn)3 組>對(duì)照組1>試驗(yàn)4 組>試驗(yàn)2 組>試驗(yàn)5 組，瘤胃細(xì)菌群落豐度從高到低依次為：對(duì)照組1>試驗(yàn)4 組>試驗(yàn)6 組>試驗(yàn)7 組>試驗(yàn)2 組>試驗(yàn)3組>試驗(yàn)5 組，各組間差異不顯著。 說明本試驗(yàn)條件下添加白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃細(xì)菌多樣性及物種群落豐度沒有顯著影響。 試驗(yàn)5 組瘤胃細(xì)菌多樣性和群落豐度較低的原因可能是該組瘤胃液pH 較低抑制了某些微生物的生長(zhǎng)繁殖， 同時(shí)在發(fā)酵白酒糟促進(jìn)較為優(yōu)勢(shì)的瘤胃微生物生長(zhǎng)繁殖的情況下， 會(huì)一定程度再次限制瘤胃中較低含量細(xì)菌的活動(dòng)。

3.2.2 白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響 研究表明， 西門塔爾牛（吳瓊等，2019）和牦牛（曾鈺等，2020）瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌門主要是擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），本試驗(yàn)研究結(jié)果與其相同，說明牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌門（Bacteroidetes 和Firmicutes）不受品種、年齡和日糧結(jié)構(gòu)的影響。 本試驗(yàn)中，各個(gè)處理組豐度較高的門均為6 個(gè)， 分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門（Spirochaetae）、變形菌門（Proteobacteria）、變形菌門（Actinobacteria）和纖維桿菌門（Fibrobacteres）。其中發(fā)酵白酒糟組放線菌門豐度顯著低于白酒糟組，而放線菌大部分是腐生菌，推測(cè)可能是酒糟經(jīng)發(fā)酵處理后有害菌減少， 飼用后可改善瘤胃菌群環(huán)境，抑制放線菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵酒糟組和白酒糟組與對(duì)照組相比在其他菌門均無顯著差異， 這表明白酒糟與發(fā)酵白酒糟替代粗飼料對(duì)育肥牛瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌群無不良影響， 為酒糟在肉牛飼料中新的應(yīng)用方式提供了理論指導(dǎo)。

研究發(fā)現(xiàn)，核心菌群是反芻動(dòng)物共有的，屬水平上，普雷沃氏菌屬是瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌屬，其優(yōu)勢(shì)地位與飼糧結(jié)構(gòu)無關(guān) （趙娜等，2019； 李嵐捷等，2017；Jami 等，2012）， 普雷沃氏菌屬是主要的蛋白降解菌之一， 可降解瘤胃中蛋白質(zhì)和淀粉等高分子物質(zhì)（Avgustin 等，1997）。 本試驗(yàn)中，各組育肥瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌屬均為普雷沃氏菌屬， 與前人研究結(jié)果（曾鈺等，2020；趙娜等，2019；李嵐捷等，2017；Jami 等，2012）一致；擬桿菌屬BS11 隨發(fā)酵白酒糟替代比例的增加，豐度顯著降低，推測(cè)可能是隨著替代比例的增加，飼糧中纖維含量降低，粗蛋白質(zhì)和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量升高， 普雷沃氏菌屬處于優(yōu)勢(shì)地位，抑制了擬桿菌屬BS11 的生長(zhǎng)，導(dǎo)致豐度降低； 瘤胃球菌屬是瘤胃中主要的纖維降解菌，能產(chǎn)生大量的纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶，降解粗飼料中的纖維素和半纖維素。發(fā)酵白酒糟40%和60%組替代較對(duì)照組和20%替代組瘤胃球菌屬2 豐度顯著提高， 推測(cè)可能是白酒糟經(jīng)發(fā)酵工藝處理后產(chǎn)生了可以促進(jìn)瘤胃球菌生長(zhǎng)、 增殖的物質(zhì)。 各處理組Prevotella 1 和Prevotellaceae UCG-003 含量均沒有顯著的差異，但試驗(yàn)7 組Prevotella 1 含量比試驗(yàn)4 組提高，相比白酒糟， 飼糧中高用量發(fā)酵白酒糟提高了西雜牛瘤胃Prevotella 1 含量，可能是白酒糟的酸度和稻殼等因素一定程度上抑制了Prevotella 1 的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)。 Bacteroidales 主要降解飼糧中植物多糖，本試驗(yàn)中飼糧粗料中20%發(fā)酵白酒糟和60%白酒糟用量有利于Bacteroidales RF16 group 的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)， 但隨著發(fā)酵白酒糟用量的提高其生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)受到抑制， 而白酒糟用量的提高有利于Bacteroidales RF16 group 生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)， 可能是Prevotella 和Bacteroidales RF16 group 對(duì)飼糧淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的利用相似， 存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，當(dāng)發(fā)酵白酒糟添加量較低時(shí)，同時(shí)促進(jìn)了兩者的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)，隨著添加量升高，優(yōu)勢(shì)更大的Prevotella 1 利用資源大量繁殖，逐漸抑制Bacteroidales RF16 group 的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)； 而白酒糟用量較高時(shí)，可能因?yàn)樗岫取⒌練さ纫蛩匾欢ǔ潭壬喜焕赑revotella 1 的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)，從而使Bacteroidales RF16 group 更能充分利用飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具體原因還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中各處理組瘤胃發(fā)酵pH 均在正常范圍內(nèi)。 白酒糟和發(fā)酵白酒糟有利于瘤胃液NH3-N的轉(zhuǎn)化和MCP 的合成，且發(fā)酵白酒糟效果優(yōu)于白酒糟。 發(fā)酵白酒糟相比白酒糟更有利于改善西雜牛瘤胃發(fā)酵方式。

白酒糟和發(fā)酵白酒糟對(duì)西雜牛瘤胃細(xì)菌多樣性和物種群落豐度沒有影響， 對(duì)西雜牛瘤胃微生物門水平上的兩種主要優(yōu)勢(shì)菌（擬桿菌門、厚壁菌門）豐度沒有影響。 本研究中，60%發(fā)酵白酒糟替代組較其他組可產(chǎn)生更多的MCP，能提高飼料原料氮利用效率和瘤胃微生物Shannon 指數(shù)， 降低Simpson 指數(shù)，更有利于維持瘤胃微生物多樣性。