下調miRNA-217對UVB誘導人皮膚成纖維細胞氧化損傷及Sirt1/FOXO1通路的影響*

安 慶，惠 坤，朱東寧

(1.西北大學附屬醫院/西安市第三醫院皮膚科,西安 710018；2.陜西省中醫醫院皮膚科,西安 710003；3.西北婦女兒童醫院皮膚科,西安 710061)

皮膚是保護人體免受有毒化學物質污染和紫外線輻射的第一道防線[1]。中波紫外線(ultraviolet B，UVB，280～320 nm)能夠穿透表皮到達真皮上層，造成皮膚DNA和氧化應激損傷[2-3]。此外，UVB輻射能夠提高皮膚光老化和致癌風險[4]。研究顯示，微RNA(microRNA，miRNA)是19～24個核苷酸的非編碼RNA，可參與調控UVB造成的皮膚細胞損傷過程[5]。胡翠等[6]研究顯示，miRNA-1246靶向抑制絲裂原活化蛋白激酶14參與調控皮膚成纖維細胞增殖活性。毛麗艷等[7]研究報道，miRNA-26a靶向調控組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶2調控長波紫外線(ultraviolet A,UVA)照射誘導皮膚成纖維細胞增殖活性，影響細胞光老化。有研究發現，在皮膚成纖維細胞中，miRNA-217過度表達能夠促進細胞衰老[8]。沉默信息轉錄調節因子1(silent information transcription regulator 1，Sirt1)/叉形頭轉錄因子1(forkhead transcription factor 1，FOXO1)途徑與細胞氧化應激水平密切相關[9]，但miRNA-217與人皮膚成纖維細胞(human foreskin fibroblasts，HFF)的UVB輻射損傷及其與Sirt1/FOXO1關系尚不清楚。本研究擬通過UVB損傷HFF-1模型，探討miRNA-217對HFF-1細胞損傷的影響機制，為臨床預防皮膚疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1主要材料

HFF-1(SCSP-109)來源于中國科學院細胞庫；杜氏改良Eagle培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養液(11995)、細胞凋亡試劑盒(CA1020)、過氧化氫酶(catalase，CAT，BC0200)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，BC0025)試劑盒、胎牛血清(11011-6123)、細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8，CA1210)、放射免疫沉淀試驗(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(R0010)、逆轉錄試劑盒(T2210-200T)均購自北京索萊寶有限公司；miRNA-217 抑制劑、miRNA-217 陰性對照(negative control，NC)由廣州銳博生物生物技術有限公司設計；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein yellow diacetate，DCHF-DA，D399)、Sirt1(PA5-17074)和FOXO1(82358)兔抗人多克隆抗體、β-肌動蛋白(β-actin，MII0201)小鼠抗人單克隆抗體、山羊抗兔(A32731)和山羊抗小鼠lgG(H+L)二級抗體(A32723)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要儀器

HF160W型CO2細胞培養箱購自上海Heal Force公司；EVOS M5000細胞成像系統、ProFlex型PCR儀(ProFlex)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；WD-9413C型凝膠成像分析系統購自上海添時科學儀器有限公司；ELX-8081U型酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

將HFF-1細胞培養于含有10%(V/V)胎牛血清、1%(V/V)雙抗的DMEM培養基，置于37 ℃、5%(V/V)CO2環境中培養至3～5代，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2UVB照射及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)實驗

參照文獻[10]方法照射HFF-1細胞1、2、3、4 d后設置為UVB組，另取HFF-1細胞作為正常組。根據RNA試劑盒說明書提取各組總RNA，逆轉錄獲得cDNA，PCR擴增后，以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miRNA-217相對表達水平。反應條件如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火，延伸30 s，40個循環。miRNA-217和U6由上海生工生物工程有限公司設計合成，見表1。

表1 miRNA-217和U6引物序列

1.2.3細胞分組及轉染

將HFF-1細胞分為對照組、miRNA-217 NC組和miRNA-217 抑制劑組，根據轉染試劑盒操作說明轉染miRNA-217 NC組和miRNA-217 抑制劑組，12 h后更換為新鮮培養液孵育6 h，參照1.2.2對各組進行連續3 d的UVB照射，并檢測miRNA-217表達水平。

1.2.4CCK-8實驗

將細胞接種于96孔板(5.0×104個/孔)，分組處理后，按照CCK-8說明書測量各孔吸光值(A)，計算細胞活力(%)。細胞活力(%)=[A(轉染)-A(調零孔)]/[A(未轉染)-A(調零)]×100%。

1.2.5凋亡實驗

根據試劑盒說明書處理1.2.3各組細胞后，流式細胞儀檢測凋亡變化，計算凋亡率。凋亡率=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。

1.2.6活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測

將各組細胞經磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗后，加入DCHF-DA探針，避光保存15 min，無血清培養基清洗后，熒光顯微鏡下(λEx=488 nm，λEm=525 nm)觀察并記錄。

1.2.7CAT、SOD和MDA檢測

根據CAT、SOD和MDA試劑盒說明書步驟，檢測各組上述指標水平。

1.2.8Western blot檢測

RIPA提取總蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白總濃度，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、轉膜、封閉1 h后，加入一抗Sirt1、乙酰化FOXO1(Ac-FOXO1)、FOXO1和β-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜，加入二抗(1∶10 000)，曝光顯影，分析條帶。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 UVB照射后miRNA-217表達變化

與正常組比較，相同時間時，UVB組miRNA-217表達水平明顯升高(P<0.05)；與UVB組照射1 d比較，UVB組照射2、3、4 d后細胞中miRNA-217表達水平依次升高(P<0.05)。因3、4 d增幅縮小，差異無統計學意義(P>0.05)，故選取UVB照射3 d進行后續實驗。各組細胞miRNA-217表達水平比較，見表2。

表2 正常組與UBV組細胞miRNA-217表達水平比較

2.2 轉染后UVB誘導的HFF-1細胞miRNA-217表達水平

與正常組比較，對照組miRNA-217表達水平明顯升高(1.03±0.08vs.2.52±0.08，P<0.05)；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組miRNA-217表達水平明顯降低(2.52±0.08vs.1.14±0.03，2.48±0.07vs.1.14±0.03，P<0.05)。

2.3 各組HFF1細胞存活率比較

與正常組比較，對照組細胞存活率明顯降低[(100.00±5.23)%vs.(51.29±3.46)%，P<0.05]；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細胞存活率明顯升高[(51.29±3.46)%vs.(83.94±3.91)%，(48.73±4.82)%vs.(83.94±3.91)%，P<0.05]。

2.4 各組HFF1細胞凋亡率比較

與正常組比較，對照組細胞凋亡率明顯升高[(2.06±0.68)%vs.(13.86±1.14)%，P<0.05]；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細胞凋亡率明顯降低[(13.86±1.14)%vs.(3.13±0.95)%，(12.56±1.70)%vs.(3.13±0.95)%，P<0.05]；對照組與miRNA-217 NC組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組HFF1細胞凋亡情況

2.5 各組HFF1細胞ROS水平比較

與正常組比較，對照組HFF-1細胞中ROS水平明顯升高(P<0.05)；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組HFF-1細胞中ROS水平明顯降低(P<0.05)；對照組與miRNA-217 NC組ROS水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。熒光顯微鏡下觀察各組HFF-1細胞ROS水平，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組HFF-1細胞ROS水平(綠色熒光代表ROS水平，×200)

2.6 各組HFF-1細胞CAT、SOD和MDA水平比較

與正常組比較，對照組細胞CAT和SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細胞CAT和SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)；對照組與miRNA-217 NC組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組HFF-1細胞CAT、SOD活性和MDA水平比較

2.7 各組HFF1細胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1表達水平比較

與正常組比較，對照組HFF-1細胞Sirt1和FOXO1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表達和Ac-FOXO1/FOXO1比值明顯升高(P<0.05)；與對照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組HFF-1細胞Sirt1和FOXO1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表達和Ac-FOXO1/FOXO1比值明顯降低(P<0.05)；對照組與miRNA-217 NC組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3，表4。

A：正常組；B：對照組；C：miRNA-217 NC組；D：miRNA-217抑制劑組。

表4 各組HFF1細胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1蛋白表達水平比較

3 討 論

紫外線長時間照射是引起皮膚損傷的主要因素之一，近年來研究發現，miRNA在皮膚細胞代謝、衰老、癌變中起著至關重要的作用。miRNA-186-5p通過抑制Twist相關蛋白1蛋白表達誘導HFF1衰老，miRNA-186-5p可能是干預皮膚老化的潛在靶點[11]。miRNA-22-3p在皮膚鱗狀細胞癌細胞中低表達，其過表達通過調控結構蛋白家族1蛋白表達致癌細胞增殖，促進其凋亡[12]。吳林燕等[13]研究顯示，miRNA-217在瘢痕疙瘩成纖維細胞中高表達，抑制miRNA-217調控DNA 甲基轉移酶 1蛋白表達可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、促進細胞凋亡。本研究結果顯示，隨UVB照射時間的延長，HFF-1細胞中miRNA-217表達逐漸增加，與文獻[6]研究結果一致，提示UVB照射后HFF-1細胞中miRNA-217異常高表達。與正常組比較，對照組細胞中miRNA-217表達明顯升高，細胞存活率明顯降低，凋亡率明顯升高。提示UVB長時間照射后引起HFF-1細胞損傷且可能與細胞中miRNA-217異常表達有關。

UVB長時間照射造成皮膚細胞損傷與皮膚抗氧化系統紊亂有關。ROS參與機體氧化應激反應，UVB引起皮膚細胞損傷后ROS分泌水平增加，清除率低[14]。抗氧化酶CAT和SOD為細胞抗氧化防御體系的重要物質，對機體氧化動態平衡至關重要[15]。MDA是細胞氧化程度和受損的重要標志[16]。有研究顯示，提高皮膚組織中SOD、CAT的活力，降低MDA水平、清除ROS可有效地減輕紫外線照射引起的皮膚損傷[17]。miRNA-217在氧化應激誘導的內皮細胞凋亡中被明顯上調[18]。在高糖誘導的足細胞中，阻斷miRNA-217表達可以減輕高糖對足細胞活力不利作用，并抑制ROS水平和細胞凋亡，從而拮抗細胞損傷[19]。本研究發現，miRNA-217 抑制劑干預后，HFF-1細胞存活率及CAT、SOD活性明顯升高，細胞凋亡率、MDA水平明顯降低，提示下調miRNA-217能夠提高UVB誘導下HFF-1細胞的抗氧化能力。

Sirt1是一種組蛋白脫乙酰基酶，能夠促進FOXO1脫乙酰化發揮抗氧化應激作用[20]。MO等[21]研究發現，使用Sirt1激活劑能夠促進FOXO1核表達，逆轉脂多糖誘導的鼠胰島細胞氧化損傷；在低密度脂蛋白引起血管內皮細胞損傷中，激活Sirt1/FOXO1可以提高細胞的抗氧化能力[22]。此外，體內外實驗證明，心肌缺血再灌注損傷的心肌細胞或心臟中Sirt1上調，FOXO1乙酰化下調有利于抑制細胞凋亡和氧化應激反應[23]。本研究結果顯示，miRNA-217 抑制劑干預后，Sirt1/FOXO1通路被激活，Ac-FOXO1水平明顯降低，提示下調miRNA-217可能通過激活Sirt1/FOXO1途徑，抑制UVB誘導的HFF-1細胞氧化應激反應。MENGHINI等[24]證實，miRNA-217能夠靶向促進Sirt1表達，降低FOXO1乙酰化，抑制人臍靜脈內皮細胞衰老，因此，推測下調miRNA-217水平可能通過靶向促進Sirt1蛋白表達，抑制FOXO1乙酰化，減輕UVB誘導所致HFF-1細胞氧化應激損傷。

綜上所述，下調miRNA-217可抑制UVB誘導的HFF-1細胞凋亡，降低氧化應激，這可能與激活Sirt1/FOXO1信號通路相關，表明miRNA-217可能是預防UVB引起的皮膚疾病的潛在靶標。然而，光損傷作為皮膚病的主要環境因素，其機制復雜，因此，仍需進一步聯合動物模型和臨床試驗進行探討。