不同條件下臭氧溶液對牙周致病菌的體外抑制作用*

陳 嵐，楊 洋，劉興容，徐 皚△

(1.西南醫科大學口腔醫學院/西南醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科，四川瀘州 646000；2.漢中市口腔醫院牙周黏膜科，陜西漢中 723000)

牙周病是混合細菌感染性疾病，由牙菌斑中的可疑致病菌通過多種機制干擾宿主防御能力而引發的牙周破壞[1]。基礎治療是牙周病治療的基本方法[2],包括機械措施和化學方法，單純依靠機械方式無法徹底清除菌斑，而牙周輔助應用氯己定等抗菌藥物又會造成牙齒變色和短暫的味覺障礙等不良反應[3]，因此，需要新的抗菌藥物用以輔助治療牙周病。具有抗菌作用的臭氧毒副作用小，已經被應用于皮膚病[4]、骨關節炎的治療[5]中，近年來，也以氣體、水溶液、植物油的形式應用于根管消毒、口臭、下頜骨壞死、齲齒及牙周炎等的治療中[6]。臭氧作為輔助治療的應用代表了治療慢性牙周炎的一種新方法[7]。本研究在前期已申請的臭氧溶液潔牙機的基礎上，設計并探討其作為牙周病輔助治療新方法的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

標準菌株：牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis,P.g)ATCC33277、具核梭桿菌(fusobacterium nucleatum，F.n)ATCC10957、黏性放線菌(actinomyces viscosus，A.v)ATCC 19246凍干菌株均購自四川大學重點微生物實驗室。小型電解式臭氧機百特M-8600D購自百特科技環保有限公司；體視顯微鏡購自英國Alpha公司；顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；厭氧生化培養箱厭氧培養箱購自上海躍進醫療器械廠；離心沉淀機購自廣東省醫療器械廠；微量移液器購自北方同正生物技術發展有限公司；比濁儀購自上海器械廠。

1.2 方法

1.2.1臭氧溶液的制備、濃度及半衰期的測定

將臭氧機產生的臭氧以多孔砂球棒連續通入潔牙機上的無菌蒸餾水中，分別在10、15、20 ℃制備臭氧溶液，并于臭氧溶液產生后的5、10、15、20、25 min以碘量法測定溶液中的臭氧濃度及最大實驗室濃度。操作重復3次，取平均值。根據回歸性分析計算出各溫度下臭氧溶液的半衰期。

1.2.2細菌的復蘇、培養和鑒定

菌株凍存管復蘇后各取50 μL劃線接種于CDC血瓊脂平板上，置于厭氧箱(80%N2、10%H2、10%CO2)中37 ℃厭氧培養72 h。經革蘭染色鏡檢為純培養后，于CDC液體培養基增菌至對數期，用比濁儀調節菌懸液密度至1.5×108cfu/mL備用。

1.2.3不同濃度、溫度及作用時間下臭氧溶液的抑菌實驗

實驗分為3組：(1)實驗組。分別于10、15、20 ℃取2.85、1.96、1.12 mg/L臭氧溶液各9 mL，共9個亞組，加入裝有1 mL菌懸液的離心管中，震蕩混勻，控制作用時間分別為30、60 s，取0.5 mL菌懸液，加入5 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，1 000×g離心5 min，棄上清液，再加入5 mL PBS，震蕩混勻，取菌懸液0.1 mL，接種于CDC血瓊脂平皿中，均勻涂布后置于37 ℃恒溫培養箱培養72 h。(2)陽性對照組。取3% H2O2溶液9 mL，加入裝有1 mL菌懸液的離心管中，震蕩混勻，控制作用時間分別為30、60 s，取菌懸液0.5 mL，加入5 mL PBS,1 000×g離心5 min，棄上清液，再加入5 mL PBS，震蕩混勻，取菌懸液0.1 mL，接種于CDC血瓊脂平皿中，相同條件培養72 h。(3)陰性對照組。取無菌蒸餾水9 mL，加入裝有1 mL菌懸液的離心管中，震蕩混勻，控制作用時間分別為30、60 s，取菌懸液0.5 mL，加入5 mL PBS,1 000×g離心5 min，棄上清液，再加入5 mL PBS，震蕩混勻，取菌懸液0.1 mL，接種于CDC血瓊脂平皿中，培養相同時間。

1.2.4菌落計數

72 h時觀察菌落形態，對各組菌落計數，結果取對數，記為Lgcfu/mL。實驗重復3次，結果取平均值。計算各組抑菌率，抑菌率=(陰性對照組-實驗組)/陰性對照組×100%。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 臭氧溶液的濃度及半衰期

在不同濃度，不同溫度下的臭氧溶液均隨放置時間延長濃度有不同程度的下降，水溫越高分解速度越快，半衰期越短。在水溫為10、15、20 ℃時臭氧溶液初始濃度分別為2.85、1.96、1.12mg/L，半衰期分別為 69.00、40.20、30.00 min。不同溫度下的臭氧溶液濃度，見表1。

表1 不同溫度下臭氧溶液濃度(mg/L)

2.2 細菌革蘭染色結果

3株菌株經革蘭染色后，鏡下觀察可見P.g ATCC 33277為革蘭陰性球菌；F.n ATCC 10957為革蘭陰性梭形桿菌，兩端尖銳，中間膨大；A.v ATCC 19246為革蘭陽性桿菌，多形性，不規則。形態特點均符合3種菌株的理論形態，見圖1。

A：P.g ATCC33277；B：F.n ATCC10957；C：A.v ATCC19246。

2.3 臭氧溶液的體外抑菌實驗結果

2.3.1臭氧溶液在不同溫度、濃度、作用時間下對P.g的作用

與陰性對照組比較，各實驗組臭氧溶液對P.g均具有明顯的抑菌效果，臭氧溶液的濃度越高，溫度越高，抑菌效果越強。臭氧溶液濃度為2.85 mg/L，溫度20 ℃,作用30 s時對P.g的抑菌率最高(82.35%)，抑菌效果與3%H2O2效果相當；而濃度為1.12 mg/L，溫度10 ℃，作用30 s時抑菌效果最低(23.53%)，見圖2。3種濃度的臭氧溶液對P.g的抑菌結果經單因素方差分析，各組間比較差異均有統計學差異(F=28.165，P<0.01)。作用時間相同時(30、60 s)，與陰性對照組比較，9組臭氧溶液對P.g的抑菌效果抑菌整體趨勢均存在明顯差異(P<0.01)。與陽性對照組比較，作用30 s時，只有2.85 mg/L(15、20 ℃)差異無統計學意義(P>0.05)；作用60 s時，除2.85 mg/L(20 ℃)差異無統計學意義(P>0.05)外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。作用濃度、溫度相同，作用時間不同時，除1.96 mg/L(10 ℃)組差異有統計學差異外(P<0.05)，其余各組均差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組溶液對P.g作用30、60 s后平均菌落計數比較(Lgcfu/mL)

圖2 各組溶液對P.g不同作用時間及溫度下的抑菌效果

2.3.2臭氧溶液在不同溫度、濃度、作用時間下對F.n的作用

與陰性對照組比較，3種濃度的臭氧溶液對F.n均有生長抑制作用，濃度越高，抑菌效果越明顯。臭氧濃度為2.85 mg/L，溫度為20 ℃，作用60 s時，抑菌率可達86.36%，抑制效果最強；1.12 mg/L(10 ℃)組作用30 s時抑菌率最低(42.22%)，見圖3。3種濃度的臭氧對F.n的抑菌結果經單因素方差分析，各組間差異有統計學意義(F=62.22,P<0.01)。作用時間相同時，3種濃度的臭氧溶液作用30、60 s與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01);與陽性對照組比較，作用30、60 s，除2.85 mg/L組差異無統計學意義(P>0.05)外，其余各組均差異有統計學意義(P<0.05)。不同作用時間下，除1.12 mg/L(10 ℃)組差異有統計學意義(P<0.05)外，其余各組均差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組溶液對F.n作用30、60 s后平均菌落計數比較(Lgcfu/mL)

圖3 各組溶液對F.n不同作用時間及溫度下的抑菌效果

2.3.3臭氧溶液在不同溫度、濃度、作用時間下對A.v的作用

與陰性對照組比較，不同濃度的臭氧溶液對A.v的生長均具有抑制作用，濃度越高，抑制作用越強。當作用濃度為2.85 mg/L，作用溫度為15 ℃作用60 s時抑制作用最大，抑菌率為81.25%；濃度為1.12 mg/L，溫度為10 ℃，作用30、60 s的效果一樣，抑菌率最低(28.13%)，見圖4。3種濃度的臭氧溶液對A.v的抑菌結果經單因素方差分析，各組間差異有統計學意義(F=19.899，P<0.01)。作用時間相同時，3種濃度的臭氧溶液作用30、60 s與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01);與陽性對照組比較，作用30 s時，各組均差異有統計學意義(P<0.05)，作用60 s時，除2.85 mg/L(15、20 ℃)組差異無統計學意義(P>0.05)外，余各組均差異有統計學意義(P<0.05)。當作用濃度、溫度相同，作用時間為30、60 s時，只有2.85 mg/L(15 ℃、20 ℃)組差異有統計學意義(P<0.05)，其余差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

圖4 各組溶液對A.v不同作用時間及溫度下的抑菌效果

表4 各組溶液對A.v作用30、60 s后平均菌落計數比較(Lgcfu/mL)

3 討 論

牙周病是常見的口腔感染性疾病之一，不僅損害患者的咀嚼功能，影響生活質量，還是低體重早產兒、糖尿病等[8]的重要危險因素。P.g是牙周病變區的“關鍵菌”，自身的菌毛促進細菌黏附和生物膜的形成，脂多糖引發炎癥，干擾宿主的免疫反應[9]；F.n是菌斑生物膜中最豐富的物種，也是作為口腔早期和晚期定植細菌之間的橋梁細菌，促進了牙菌斑的形成[10]。A.v是與根面齲和牙周病相關的一種常見的革蘭陽性菌，通過黏附素在牙齒表面上黏附和定植，加速菌斑的形成和沉積[11]，加重牙周病的進展。這3種牙周致病菌均參與牙齦炎和牙周炎的發生、發展，導致牙周組織的破壞，因此，選取此3種菌作為本研究的實驗對象。

臭氧具有強大的氧化性，低濃度臭氧就可以通過氧化磷脂和脂蛋白破壞細菌包膜的完整性，破壞葡萄糖氧化酶、RNA、蛋白質等[12]，從而干擾細菌代謝，阻礙細菌的生長繁殖，發揮殺菌抑菌的作用。臭氧相較于其他抗菌藥物，具有無耐藥性產生，無局部刺激等特性，有學者將臭氧應用于牙周病治療并取得一定的療效。NARDI等[13]將確診為牙周炎的96例患者，隨機分為實驗組和對照組，實驗組刮治后使用臭氧化橄欖油漱口水，對照組僅完成刮治，3個月后發現實驗組患者的探診出血和唾液金屬蛋白酶-8得到了更明顯的改善。在25例完成齦下刮治的中度至重度慢性牙周炎病例中，以臭氧橄欖油和氯己定作為輔助沖洗治療，結果臭氧橄欖油組改善牙周病的菌斑效果與氯己定相當[14]。但也有研究在牙周治療期間，以氣態臭氧作用于牙周袋內，2周后發現臭氧相比于對照組無明顯的促進作用[15]。隨著研究的深入，不同形式的臭氧應用于牙周病的輔助治療，然而氣態臭氧的使用需要密閉空間，長時間的吸入可能會引起鼻炎、咳嗽、頭痛甚至惡心、嘔吐[6]，臭氧化油作為一種抗菌緩釋劑，發揮廣泛的抗菌作用的同時會產生難聞的氣味，再加上其黏性高[16]，不適合作為沖洗液。相較之下，液態臭氧具有使用方便，穩定性高和毒副作用少等優點。本研究證實了在不同條件下臭氧溶液對幾種牙周致病菌均有抑制作用，只是最適抑菌條件不一樣，針對不同細菌，選擇適宜的溫度，作用時間適當的延長，可以增強臭氧溶液的抑菌效果。臨床上如果能將臭氧發生器與潔牙機結合使用，通過時間模塊，溫度模塊，濃度模塊的設定，可達到制備出不同濃度、溫度、作用時間的臭氧溶液的目的，針對牙周袋內特定的優勢菌采用特定臭氧溶液輔助治療，以取得更好的殺菌效果，并省去了牙周袋內輔助給藥的治療步驟。然而臭氧溶液作為臨床潔牙的沖洗液達到牙周病的輔助治療效果究竟如何，還需要更多高質量的臨床實驗研究來證明。

本實驗通過臭氧溶液對3種牙周致病菌在體外不同條件下的抑菌效果研究，得出以下結論：(1)在溫度設定為10、15、20 ℃時臭氧溶液初始濃度分別為2.85、1.96、1.12 mg/L，半衰期分別為 69.00、40.20、30.00 min；(2)3種濃度的臭氧溶液在3種溫度下對3種牙周致病菌作用30、60 s均有抑制作用；(3)當溫度設定在20 ℃、濃度2.85 mg/L，作用30 s時對P.g生長抑制作用最強；(4)當溫度設定在20 ℃、濃度2.85 mg/L，作用60 s時對F.n的抑制作用最強；(5)當溫度設定在15 ℃、濃度為2.85 mg/L，作用60 s時對A.v抑菌性最強。