lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-367-3p調控多發性骨髓瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制

饒琦 王丹丹 羅婷 趙佳莉 趙寅

(四川大學華西醫院血液科·四川大學華西護理學院，四川 成都 610041)

多發性骨髓瘤是起源于B細胞的一種致命性腫瘤，約占所有血液惡性腫瘤的10%[1]。隨著治療方案的改進和自體干細胞移植清髓化療的使用，多發性骨髓瘤患者的治療取得巨大進步，但其在很大程度上仍無法治愈[2]，并且多發性骨髓瘤的發病機制仍有待闡明。長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA，lncRNA)PITPNA反義RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是一種新發現的lncRNA，在乳頭狀甲狀腺癌[3]、非小細胞肺癌[4]和結直腸癌[5]中高表達，通過海綿不同的微小RNA (MicroRNA，miRNA)起著致癌因子的作用加速腫瘤進展。但lncRNA PITPNA-AS1在多發性骨髓瘤中的功能有待探索。最近的證據表明，miRNA參與多發性骨髓瘤的發展[6]。miR-367-3p作為抑癌因子，涉及多種腫瘤的病理過程，例如宮頸癌組織和細胞系中miR-367-3p低表達，miR-367-3p過表達抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[7]。上調的miR-367-3p使肺癌的增殖和遷移能力減弱[8]。但是，miR-367-3p是否調節多發性骨髓瘤的生長和轉移仍是未知的。因此，本研究探討lncRNA PITPNA-AS1在多發性骨髓瘤中的表達情況及其對多發性骨髓瘤對細胞增殖、遷移和侵襲行為的影響，分析其潛在機制，以期為多發性骨髓瘤的分子療法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 多發性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2(美國型培養物保藏中心)；小鼠成骨細胞系MC3T3-E1(無錫欣潤)；siRNA-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1)、siRNA NC (si-NC)、pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、miR-367-3p mimics、miR-367-3p inhibitors (anti-miR-367-3p)、mimics/inhibitors NC (miR-NC/anti-miR-NC)(上海GenePharma)；細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、雙熒光素酶試劑盒(上海Yeasen)；蛋白質提取試劑盒(北京Solarbio)；基質金屬蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)2兔多克隆抗體、MMP9兔多克隆抗體、二抗(美國Abcam)；螢光素酶報告載體pGL3、AMV反轉錄酶試劑盒(美國Promega)；SYBR Green Real Time PCR Master Mix試劑盒(德國Roche)。

1.2 細胞培養 將RPMI-8226、MM1. S、OPM-2、MC3T3-E1細胞保存在Roswell Park Memorial Institute 1640培養基(RPMI1640)中，并混合有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。MC3T3-E1細胞用混合有10% FBS的α-MEM培養基。所有細胞均在5% CO2、濕潤培養箱中于37℃孵育。

1.3 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR) TRIzol試劑用于從成骨細胞MC3T3-E1、多發性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中提取RNA。采用AMV反轉錄酶試劑盒將2 μg總RNA反轉錄成cDNA，然后使用SYBR Green Real Time PCR Master Mix試劑盒在ABI 7900 Real-Time PCR中進行qRT-PCR。以GAPDH和U6為內參，通過2-ΔΔCt方法估算lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p表達。引物序列：GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(Forward)，5′-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3′(Reverse)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(Forward)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(Reverse)；lncRNA PITPNA-AS1 5′-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3′(Forward)，5′-CCTACTGACAGGATGTCCT-3′(Reverse)；miR-367-3p 5′-GCAGAATTGCACTTTAGCAATG-3′(Forward)，5′-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3′(Reverse)。

1.4 細胞轉染與分組 將多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226以1×105細胞/孔接種到6孔板，培養至70%～80%純度，使用Lipofectamine 2000，在RPMI-8226細胞中轉染si-NC (si-NC組)、si-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1組)、miR-NC (miR-NC組)、miR-367-3p mimics (miR-367-3p組)，或同時轉染anti-miR-NC與si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1組)、anti-miR-367-3p與si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS1組)，并將未轉染的細胞設為對照組(NC組)。48 h后利用qRT-PCR檢測RPMI-8226細胞的轉染情況，并進行后續測定。

1.5 Western Blot 使用蛋白質提取試劑盒對RPMI-8226細胞進行蛋白質分離。將30 μg蛋白質樣品上樣到12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在脫脂奶中封閉，然后與抗MMP2(1：2 000稀釋度)、MMP9(1：2 000稀釋度)的特異性一抗一起孵育，然后在辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1：5 000稀釋)中進行探測。使用化學發光試劑對蛋白條帶進行可視化和分析。

1.6 CCK-8實驗 將RPMI-8226細胞以5×103/孔接種在96孔板中，48 h后引入10 μL CCK-8試劑，將細胞在37℃下再保持1 h。使用Biotech酶標儀記錄每個孔在450 nm處的吸光度A值，細胞活力與A值成正比。

1.7 細胞克隆形成實驗 將RPMI-8226細胞以300細胞/孔接種在6孔板中。常規培養2周后，將克隆的細胞(>50細胞)用甲醇固定，并用0.1%結晶紫染色，然后在顯微鏡下計數。

1.8 Transwell實驗 RPMI-8226細胞的侵襲和遷移能力通過Transwell測定法進行評估。為了檢測侵襲能力，將無血清培養基中的4×104個RPMI-8226細胞接種到涂有Matrigel的上室中。為了進行遷移能力檢測，將無血清培養基中的1×104細胞接種到上室中。Transwell下室填充10% FBS的培養基。孵育后24 h，將遷移或侵襲性細胞用0.1%的結晶紫染色，并在光學顯微鏡下計數。

1.9 雙熒光素酶活性檢測 用starbase預測lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的結合區域。將相應的含有miR-367-3p結合位點的lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突變型(MUT)序列插入螢光素酶報告載體pGL3，以構建lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT報告基因載體。在多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226中同時轉染miR-367-3p mimics或miR-NC和lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT報告基因載體。36 h后利用雙熒光素酶試劑盒評估相對熒光素酶活性。另將pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、si-NC、si-lncRNA PITPNA-AS1轉染到RPMI-8226細胞中，48 h通過qRT-PCR測定lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況。

2 結果

2.1 在多發性骨髓瘤細胞系中lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況 與成骨細胞MC3T3-E1比較，多發性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1表達量均增加，miR-367-3p的表達量均減少(P<0.05)。將差異最顯著的RPMI-8226細胞用作后續研究對象。見表1。

表1 在多發性骨髓瘤細胞系中，lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況

2.2 干擾lncRNA PITPNA-AS1抑制多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲 在多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226中轉染si-lncRNA PITPNA-AS1來干擾lncRNA PITPNA-AS1，si-lncRNA PITPNA-AS1組較NC組減少lncRNA PITPNA-AS1、MMP2蛋白和MMP9蛋白的表達量，并降低細胞活力、克隆形式數、遷移和侵襲數量(均P<0.05)，而si-NC組較NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 干擾lncRNA PITPNA-AS1抑制多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲Table 2 Interfering with lncRNA PITPNA-AS1 inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.3 miR-367-3p高表達抑制多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲 在多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226中轉染miR-367-3p mimics，miR-367-3p組miR-367-3p表達量比miR-NC組高，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表達量、細胞活力、克隆形式數、遷移和侵襲數量均比miR-NC組低(均P<0.05)，見表3、圖2。

表3 miR-367-3p高表達抑制多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲Table 3 High expression of miR-367-3p inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.4 lncRNA PITPNA-AS1靶向調控miR-367-3p的表達 在starbase中預測miR-367-3p和lncRNA PITPNA-AS1的靶向結合(見圖3)。miR-367-3p組lncRNA PITPNA-AS1-WT相對熒光素酶活性比miR-NC組減少了0.53倍(P<0.05)，但miR-367-3p組與miR-NC組lncRNA PITPNA-AS1-MUT相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1組多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226中lncRNA PITPNA-AS1表達量比pcDNA組高，miR-367-3p表達量比pcDNA組低(均P<0.05)；si-lncRNA PITPNA-AS1組lncRNA PITPNA-AS1表達量比si-NC組低，miR-367-3p表達量比si-NC組高(均P<0.05)，見表5。

表4 miR-NC或miR-367-3p mimics與lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突變型(MUT)報告質粒共轉染多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-367-3p的表達Table 5 The expression of miR-367-3p detected by qRT-PCR

2.5 anti-miR-367-3p可以逆轉si-lncRNA PITPNA-AS1對多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的影響 在多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226細胞中同時轉染anti-miR-367-3p和si-lncRNA PITPNA-AS，anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS組miR-367-3p表達量低于anti-miR-NC+si-lncRNA

PITPNA-AS1組，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表達量、細胞活力、克隆形式數、遷移和侵襲數量均高于anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1組(均P<0.05)，見圖4、表6。

表6 Anti-miR-367-3p可以逆轉si-lncRNA PITPNA-AS1對多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

越來越多的證據表明，lncRNA分子的表達與許多腫瘤的發展和進展有關，lncRNA介導的生物學是癌癥進展的重要關鍵途徑[9-11]。由于lncRNA參與增殖、凋亡、代謝和分化，它們在包括多發性骨髓瘤在內的許多疾病的生物學過程和發病機理中起著關鍵作用[12]。lncRNA PITPNA-AS1定位于染色體17p13.3，顯示出對腫瘤生長的促進作用。Sun等[13]在肝細胞癌組織中觀察到lncRNA PITPNA-AS1升高，其在體外通過靶向miR-876-5p具有促進肝細胞癌的生長和轉移的致癌作用。Guo等[14]發現人宮頸癌組織和細胞系中lncRNA PITPNA-AS1顯著增加，其過表達促進宮頸癌細胞增殖，而lncRNA PITPNA-AS1敲除抑制細胞增殖，并且lncRNA PITPNA-AS1的調控作用與海綿miR-876-5p有關。另一項研究表明，lncRNA PITPNA-AS1在肺鱗癌樣本中高度表達，其缺失阻礙了肺鱗癌細胞的增殖和遷移能力[17]。然而lncRNA PITPNA-AS1在多發性骨髓瘤中的作用仍然未知。與前述研究相類似，本研究發現干擾lncRNA PITPNA-AS1可抑制骨髓瘤細胞RPMI-8226的增殖、遷移和侵襲。因此，確定lncRNA PITPNA-AS1在多發性骨髓瘤中同樣起到腫瘤促進劑的作用。

本研究還探討了lncRNA PITPNA-AS1在多發性骨髓瘤中的潛在機制，雙熒光素酶報告測定和qRT-PCR實驗證實miR-367-3p是lncRNA PITPNA-AS1的靶標之一。一項研究[16]表明，miR-367-3p是化療前、化療中和化療后轉移性睪丸生殖細胞癌的血清生物標志物。miR-367-3p在膠質瘤組織和細胞系中下調，作為腫瘤抑制因子，阻礙膠質瘤細胞的惡性增殖、遷移和侵襲[17-18]。Raikundalia等[19]在乳腺癌MCF-7細胞中轉染miR-367-3p，發現細胞表現出較高水平的凋亡和較低的細胞遷移。子宮內膜癌組織中的miR-367-3p顯著下調，通過抑制HMGA2的表達來抑制子宮內膜癌細胞的惡性行為[20]。然而關于miR-367-3p在多發性骨髓瘤中的研究報道鮮少。本研究發現多發性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中miR-367-3p的表達降低，還證實miR-367-3p高表達能抑制多發性骨髓瘤細胞的增殖和轉移，表明miR-367-3p是多發性骨髓瘤的抑癌基因。lncRNA通常作為miRNA海綿來調節各種癌癥的進展[21-23]。如lncRNA PITPNA-AS1通過海綿miR-129-5p促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡[3]。lncRNA PITPNA-AS1沉默通過靶向miR-32-5p抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、轉移和上皮間質轉化[4]。lncRNA OIP5-AS1在胃癌細胞中作為miR-367-3p的內源性海綿發揮致癌作用[24]。本研究中，miR-367-3p被鑒定為lncRNA PITPNA-AS1的靶miRNA，lncRNA PITPNA-AS1直接負向調控miR-367-3p的表達。此外，干擾lncRNA PITPNA-AS1對多發性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的抑制作用可被anti-miR-367-3p逆轉。這表明lncRNA PITPNA-AS1通過在多發性骨髓瘤中海綿miR-367-3p來發揮其致癌作用。

4 結論

在多發性骨髓瘤細胞中lncRNA PITPNA-AS1水平上調，而lncRNA PITPNA-AS1通過調節miR-367-3p抑制多發性骨髓瘤細胞的生長和轉移。lncRNA PITPNA-AS1/miR-367-3p調節網絡為多發性骨髓瘤的發展提供了新視角，而lncRNA PITPNA-AS1可能是多發性骨髓瘤的關鍵治療和診斷目標。