稀釋液中添加半胱氨酸對絨山羊冷凍精液品質的影響

張少華 張曉強

（1張家口市宣化職業技術教育中心 河北 張家口 075000；2包頭輕工職業技術學院乳品農牧工程系 內蒙古 包頭 014035）

在家畜精液的冷凍—解凍過程中，精液的稀釋和冷凍處理各個環節均會對精子造成一定的損傷，精液中抗氧化酶類的活力降低是影響精液品質的重要因素。在冷凍稀釋液中添加抗氧化劑來阻止或者是防止氧化應激，可降低活性氧對解凍后精子功能的不利影響。

Bilodeau[1]等證明像半胱氨酸之類的巰醇物質，可以保護冷凍—解凍后的牛精子活力免受過氧化氫的傷害。Funahashia[2]等證明，10℃下添加半胱氨酸可以提高豬精子的活力、頂體完整性和體外穿透性。Andreea[3]等研究發現，在綿羊冷凍精液稀釋液中VE和半胱氨酸都能顯著提高精子的活力，降低脂質過氧化作用。

本試驗在稀釋液中分別添加不同濃度半胱氨酸，研究其對絨山羊細管冷凍精液品質的影響，以篩選更好的冷凍稀釋液配方，提高絨山羊精液冷凍、解凍效果，減少精子損傷，不斷提高絨山羊精液冷凍技術。

1 材料與方法

1.1 采精與精子質量評定。在山西右玉縣宏宇種羊場選擇10只體格健壯、性欲旺盛、生殖健康的絨山羊人工采精。預試期(30 d)種公羊加強飼養管理，按配種期營養供應飼料，每天每只羊飼喂0.5 kg胡蘿卜，0.8 kg全價配方飼料，1個雞蛋，優質青干草自由采食；每天運動1～2 h。試驗開始后每采精2 d休息1 d，采得精液立即送往實驗室在37℃下鏡檢鮮精活率、密度和畸形率；鮮精質量要求精子密度大于1.8×109個/ml，活率大于0.7，畸形率小于10%，檢查合格的精液方可用于冷凍，本次試驗采用細管冷凍法進行冷凍。

1.2 稀釋液的配制。基礎稀釋液配方為：Tris27.1g/L，檸檬酸14.0 g/L，果糖10 g/L，卵黃20%(V/V)，甘油4%(V/V)，pH值6.8。青霉素、鏈霉素各100萬單位/L。在基礎稀釋液配方基礎上設置了5個半胱氨酸梯度：0 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L和10 mmol/L。

1.3 精液稀釋與細管冷凍精液制作(全套法國卡蘇公司進口的細管精液冷凍設備)。將檢驗合格的精液混合在一起，按照試驗組數，平均分開，隨后在37℃下用配好的稀釋液分別進行10倍稀釋，0.25 ml細管灌裝，4℃低溫平衡，程序冷凍儀冷凍，最后液氮罐保存。

1.4 精液解凍。從液氮罐中取出精液細管，迅速浸入39℃～40℃水浴鍋中，輕輕搖動直至融化(15 s)。

1.5 精液品質測定。顯微鏡鏡檢精液活率、畸形率、頂體完整率和質膜完整率。精子活率=(呈直線前進運動精子數/精子總數)×100%；畸形率=(畸形精子數/精子總數)×100%；頂體完整率=(頂體完整精子數/精子總數)×100%；質膜完整率=(尾部膨脹數/全部精子數)×100%；生存指數：將相鄰兩次檢查的平均活率與間隔時間的積相加總和為生存指數。脂質過氧化反應和抗氧化酶的測定：采用南京建成生物科技公司生產的試劑盒檢測精漿中相關抗氧化酶(MDA、SOD、GSH-PX、CAT、GSH)的活力。嚴格按照操作規程進行試驗。

1.6 數據統計。用SPSS13.0對數據進行分析，單因變量多因素方差分析和Duncan法多重比較統計，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 稀釋液中添加半胱氨酸對解凍后精液品質的影響。根據表1可知，從解凍后精子活率來看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后活率顯著高于其它組(P＜0.05)，從解凍后精子畸形率來看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后畸形率顯著低于其它組(P＜0.05)。從解凍后頂體完整率來看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后頂體完整率顯著高于其它組(P＜0.05)。從解凍后質膜完整率來看，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。從解凍后的生存指數來看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后生存指數顯著高于其它組(P＜0.05)。

表1 稀釋液中添加半胱氨酸對解凍后精液品質的影響

2.2 稀釋液中添加半胱氨酸對解凍后精液脂質過氧化反應和抗氧化酶活性的影響。根據表2可知，在稀釋液中添加半胱氨酸對解凍后精液中SOD、GSH-PX的活性和GSH的含量沒有明顯影響，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。添加7.5 mmol/L半胱氨酸組解凍后精液中MDA的濃度顯著低于其它組(P＜0.05)，CAT的活性顯著高于其它組(P＜0.05)。

表2 稀釋液中添加半胱氨酸對解凍后精液脂質過氧化反應和抗氧化酶活性的影響

3 結論與討論

在精液冷凍過程中，分別比較不同濃度梯度半胱氨酸對冷凍精液品質的影響，結果顯示：以在稀釋液中添加7.5 mmol/L半胱氨酸對冷凍精液品質的保護效果最好。

在稀釋液中添加7.5 mmol/L半胱氨酸后，冷凍精液解凍后活率有顯著的提高。Funahashi[4]等添加半胱氨酸在豬精液中，能顯著提高精子的活率和頂體完整率。在本試驗中添加半胱氨酸后，冷凍精液解凍的精子畸形率顯著降低，頂體完整率有顯著的提高，和以往的研究基本一致。

低溫保存過程影響著精子細胞，在冷凍期間或凍融之后增加了活性氧的產生或是減少了抗氧化劑含量水平。解凍后，在稀釋液中加入抗氧化劑能降低精子細胞膜開始脂質過氧化反應的風險。體細胞中抗氧化作用是通過細胞質中的酶，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化酶來實現的。而精子細胞在成熟后細胞質大量流失，從而失去了一些保護作用[5]。在精漿中非酶性抗氧化劑(抗壞血酸、α-生育酚、牛磺酸、谷胱甘肽和白蛋白)是精子防御活性氧最重要的物質。谷胱甘肽在精漿中濃度相對較高，由于谷胱甘肽含有巰基，巰基可直接與過氧化氫、超氧化物陰離子、羥自由基、氫過氧化物和烷氧基反應[5]，其在細胞抗氧化防御中有重要的作用。其它含有巰基的化合物(半胱氨酸、麥角硫因)在維護精子活率和代謝功能方面也有重要的作用[6]。半胱氨酸是含有巰基的氨基酸，半胱氨酸是細胞內谷胱甘肽生物合成的前體[7]。本試驗表明，在稀釋液中添加半胱氨酸后，解凍后精液中MDA濃度顯著降低，CAT的活性顯著提高。表明半胱氨酸在抗氧化作用和防止脂質過氧化反應方面有很好的作用。