青春期后發病的色素異常性皮膚淀粉樣變家系相關基因突變研究

馬立文 曾 霓 駱 丹

1南京醫科大學鼓樓臨床醫學院皮膚性病科，江蘇南京，210008;2南京醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科，江蘇南京，210008

原發性局限性皮膚淀粉樣變(primary localized cutaneous amyloidosis，PLCA)是一種以皮膚真皮淺層淀粉樣物質為特征的慢性瘙癢性皮膚病，本病只涉及皮膚一般不累及內臟系統[1]。臨床上一般分為斑疹型、丘疹型和結節型，其他特殊類型包括色素異常性淀粉樣變(amyloidosis cutis dyschromica，ACD)、皮膚異色病樣淀粉樣變、大皰性淀粉樣變和肛門、骶部淀粉樣變[2]。色素異常性淀粉樣變發病率低，以瘙癢為癥狀的彌漫性的色素沉著伴色素減退斑為特征，一般不伴有皮膚萎縮和毛細血管擴張。大多數的PLCA都是散發病例，家族聚集現象主要被報道在南美洲、東南亞及中國，并且這些家族多表現為常染色體顯性遺傳[3]。通過遺傳連鎖分析和候選基因篩查確定本病遺傳易感性和兩個基因突變相關：OSMR 和IL31RA基因。到目前為止有十余個OSMR基因突變和2個IL31RA突變被報道[4-9]。我們檢測了一例位于中國南部的ACD家系。

1 臨床資料

本家系兩代人中共有5例患者(圖1)，表現為常染色體顯性遺傳。先證者為發育正常的56歲女性，該患者約20年前背部出現斑點狀色素沉著和色素減退斑并伴有瘙癢，后其四肢亦出現類似皮損，無苔蘚樣丘疹，否認光敏現象及水皰史，系統檢查未見明顯異常。先證者的姐姐、弟弟、外甥及女兒均有類似皮損，均為青春期后發病，因先證者的父母已經去世。故不能求證他們是否也患此病。該家系均為非近親結婚。

圖1 ACD家系圖

2 實驗方法和儀器

2.1 DNA提取 經該家系成員知情同意并經倫理委員會批準后抽取該家系5例患者的外周血各約5 mL并用EDTA抗凝，以無皮膚病的健康人DNA為對照。采用杭州寶賽生物科技有限公司血液抽提試劑盒抽提基因組DNA。

2.2 PCR擴增 根據Genebank上序列信息(OSMR基因依據NT_006576，IL31RA基因依據NM_139017)使用Primer Premier 5設計基因引物。0SMR基因第12號外顯子引物序列：上游5’-TAAGAGACAAGAACTCACCC-3’，下游5’-GAAGTAGTCCAGAAATCCCA-3’，13號外顯子引物序列：上游5’-CTCTGCCTCTTGGGTTCA-3’，下游5’-TTGGGTATGGTGCTGACA-3’，14號外顯子引物序列：上游5’-AGAGCTGGCTATGGTTCTTC-3’，下游5’-AGCTGGTGGTGTTTCAGATG-3’，15號外顯子引物序列：上游5’-GGTGGTGCTGAGTTAACAAG-3’，下游5’-AATTGTCTCAAGGGCCACTG-3’，IL31RA基因第12號外顯子引物序列：上游5’-TGGAAGCACAGGTTCCAATG-3’，下游5’-CCAGGAAGGTTGGTGAACAG-3’。采用的PCR反應體系總體積為25 μL。使用ABI 9700PCR擴增儀，PCR反應條件：94℃預變性5 min后進入循環，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環；最終72℃延伸7 min，最后4℃保存。50 μL PCR產物中加入溴酚藍加樣緩沖液5 μL，混勻后將全部55 μL樣品分別加在2個加樣孔中，1.5%瓊脂糖凝膠 ，100 V電泳100 min，EB染色，紫外線燈下切取膠帶。杭州寶賽生物科技有限公司純化試劑盒純化。

2.3 Sanger基因測序 PCR產物分離純化后應用Big Dye Direct Sanger Sequencing Kit在ABI3500基因測序儀進行直接雙向測序，此項工作由杭州寶賽生物科技有限公司完成。測序分析結果與Genbank中人類OSMR基因的12～15號外顯子及IL31RA基因第12號外顯子的標準序列進行比對。

3 結果

3.1 皮膚科及病理檢查 患者的背部、上臂及大腿可見彌漫性的色素沉著伴色素減退斑，以背部及上肢為重(圖2a、2b)，未見明顯紅斑、丘疹、水皰、皮膚萎縮及毛細血管擴張，系統檢查未見明顯異常。取自先證者的上臂組織可見真皮乳頭層有團塊狀嗜酸性物質沉積，結晶紫染色陽性(圖2c)，提示為淀粉樣物質沉積。根據該患者臨床表現和組織病理學檢查結果診斷為ACD。

2a、2b:背部及上肢彌漫性色素沉著斑及色素減退斑；2c:真皮乳頭狀區無定形嗜酸性腫塊(HE,×100)；2d:結晶紫染色陽性(HE,×100)

3.2 臨床表現 該家系成員中Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ1及Ⅲ2可見上臂、大腿或背部可見彌漫性的色素沉著伴色素減退斑，均未見紅斑、丘疹、水皰、皮膚萎縮及毛細血管擴張，Ⅱ2伴有瘙癢，其他人無明顯瘙癢，且均無光敏及水泡史。該家系所有患者臨床表現均符合ACD，并表現為常染色體顯性遺傳。

3.3 測序結果 通過基因測序及后續比對并未發現本家系中成員存在OSMR和IL31RA基因突變。通過檢查我們發現cSNP，患者Ⅲ2存在SNP:rs2278329, c.1657G→A(圖3a)；患者Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ1存在SNP: rs161704, c.1586G→A(圖3b)。

圖3 ACD家族中OSMR和IL31RA基因突變分析

4 討論

ACD是原發性皮膚淀粉樣變的一種罕見類型，由日本的Morishma在1970年首次報道 ，ACD具有以下特點：(1)皮損為彌漫分布的色素沉著伴色素減退斑；(2)輕度或不伴癢感；(3)青春期前發??；(4)組織病理見真皮乳頭層淀粉樣樣物質沉積[10,11]。原發性皮膚淀粉樣變病中的另一亞型皮膚異色病樣淀粉樣變(poikilodenna—like cutancous amyloidosis，PCA)與ACD表現相似。Ogino等[12]在1977年將PCA分為兩類：一般型和PCA綜合征。一般型PCA的主要特征：有皮膚異色病典型皮損，有苔蘚樣丘疹，多有光敏性，于日曬后皮損加重，不具有水皰和掌跖角化，也不伴有系統受累，組織病理學改變可見真皮乳頭內有淀粉樣物質沉著，一般成年后發病。PCA綜合征的主要特征：具有皮膚異色病樣損害，苔蘚樣丘疹，組織病理檢查可見真皮層淀粉樣物質沉積，多具有光敏性，可出現水皰或掌跖角化病等，一般身材矮小，發病年齡較早。由此可見兩者臨床表現有較多重疊，且病理檢查不能鑒別，并且亦有國外學者認為ACD是皮膚異色病樣淀粉樣變的亞型[13]。因此這兩種PLCA亞型之間的關系有待進一步研究。本家系患者符合ACD的特點，因此本家系患者診斷為ACD。但是本家系患者均為青春期后發病更為少見，國外有學者曾報道一例青春期后發病的ACD[14]。另外本病需與先天性皮膚異色病、著色性干皮病、血管萎縮性皮膚異色病、皺褶部網狀色素沉著癥、遺傳性泛發性色素異常等具有皮膚異色病樣改變的疾病相鑒別，可通過組織病理及結晶紫或剛果紅特殊染色進行明確。

既往研究通過定位候選克隆的方法發現OSMR基因和IL31RA基因和PLCA發病相關，這兩種基因都屬于IL-6受體基因家族。OSMR基因編碼抑瘤素M受體β(oncostatin M receptor-beta，OSMRβ)，OSMRβ是OSM II型受體和IL31受體兩種細胞因子的組成成分[8,9]。OSM II型受體包括OSMRβ和gp130[15]，IL31RA基因編碼IL31受體α，后者與OSMRβ結合組成IL-31受體。既往報道的突變都位于OSMRβ和IL-31RA的FNIII結構域，FNIII結構域在受體的二聚化及后續的信號傳導過程中起著關鍵作用，所以本區域的突變導致Jak/STAT、MAPK及 PI3K/Akt信號通路中OSM或IL-31配體與受體結合后信號不能正常傳導[4]。體外研究中通過去除或替換FNIII結構域中的一個氨基酸證實了這個家族受體在受體二聚化中的關鍵作用[16]。中國學者進一步證實了OSMR突變導致OSM/OSMRβ/STAT5/KLF7軸的失調可能導致PLCA[17]。Arita等發現用OSM及IL-31刺激體外培養伴有OSMR突變的PLCA家族的角質形成細胞，經過OSM刺激后Jak/STAT、MAPK及PI3K/Akt 信號通路的活性減弱程度為65%～90%，IL-31刺激后活性減弱100%?，F在研究認為OSM在炎癥刺激中維持痛覺并利于發現外來的有害刺激[18]。敲除OSM后的小鼠對于急性熱、化學、機械及內臟痛等各種刺激的反應減弱或消失[19]。OSM還可以促使角質形成細胞遷移及表皮增殖[20]，推測可能和PLCA的角化過度及棘層肥厚有關。IL-31在皮膚瘙癢中起著重要作用[21]，Dillon[22]發現小鼠的淋巴細胞過表達IL-31會誘發瘙癢及皮膚病，結節型癢疹中有著較高水平的IL-31表達[23]，IL-31可以激活STAT3信號通路并通過IL-31RA調節可能和細胞凋亡相關的細胞周期蛋白[24]。因此IL31RA基因突變可能和PLCA中的瘙癢產生有關。由此可推測OSMR基因和IL31RA基因的突變可能通過影響皮膚相應的信號通路而導致PLCA的發生。

目前在OSMR基因中發現的十余種PLCA致病突變，在IL31RA基因中發現了2種PLCA致病突變。其中p.Pro694Leu和p.Gly513Asp為高頻突變位點，并且有家族史的PLCA患者中OSMR基因突變率明顯高于無家族史患者[25]這些突變集中在OSMR基因的12-15號外顯子及IL31RA基因的12號外顯子，所以我們檢測了本家系中的這些外顯子，但是并沒有檢測到突變基因，可能和樣本量少或存在其他基因突變位點有關，需要進一步驗證。不過亦有國內學者林楊楊[26]及國外學者Sakuma[24]也曾有ACD家系中沒有發現基因突變的報道。另外有學者[27]在ACD患者中發現存在GPNMB基因突變，與黑素小體形成、自噬、吞噬、組織修復和炎癥負性調節有關的GPNMB的缺失可能和ACD的發病有關，近期馮婉婷等[28]亦發現GPNMB基因在ACD患者中存在突變，為ACD致病基因的研究提供了新的方向，但是其具體致病機制尚不清楚[29]。另外，在本家系中的OSMR基因的12～15號外顯子及IL31RA基因的12號外顯子中檢測到兩處SNP，這兩處SNP也分別在兩個國內家系中被檢測出[6,30]。但是其在PLCA的發病中是否發揮作用尚不清楚。

總之，PLCA的病因存在遺傳異質性，OSMR、IL31RA和GPNMB基因在PLCA的發病中發揮重要作用，OSMR基因突變可能和PLCA的角化過度及棘層肥厚有關，IL31RA基因突變可能和PLCA瘙癢有關，GPNMB基因可能和色素異常有關。另外ACD是否有特定的基因突變位點以及SNP在PLCA的發病中是否起作用也有待進一步研究。