達格列凈預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷模型兔血清hs-cTnT、心肌結(jié)構(gòu)及細胞凋亡的影響

李偉，馬建群，朱玉紅

(1.山東第一醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濟南 250031； 2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256603)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的改變，心血管疾病已成為影響人類健康的首要問題。《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，我國大約有3.3億心血管疾病患者，其中冠心病患者約有1 139萬[1]。心肌缺血是動脈粥樣硬化和心肌梗死引起的常見臨床癥狀[2]。再灌注治療有利于修復(fù)缺血后損傷的心肌結(jié)構(gòu)，改善心功能。然而，再灌注也可能導致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，從而加重心功能不全。缺血預(yù)處理、后處理和服用抗血小板或抗血栓藥物等已被用于緩解MIRI[3-4]。由于MIRI的發(fā)生機制復(fù)雜多樣，藥物防治的臨床研究結(jié)果并不一致。目前我國批準使用的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑包括達格列凈、恩格列凈、卡格列凈，近年來已被廣泛研究[5-6]。達格列凈傳統(tǒng)上是一種降糖藥物，但多項研究表明其對缺血性心臟病和心力衰竭患者的心功能有益[7-9]。因此，達格列凈被認為是MIRI的一種潛在治療方法。本研究主要探討達格列凈預(yù)處理對MIRI的影響，為進一步拓展達格列凈在預(yù)防和治療心血管疾病中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選取普通級雄性成年新西蘭大白兔18只，體重(2.0±0.3) kg，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心[許可證號：SCXK(魯)2020-0004]。所有兔按標準適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗，實驗前禁食12 h。

1.1.2儀器與試劑 醫(yī)用低溫保存箱(BDF-86V348，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)，電子分析天平(JA2003，上海上天精密儀器有限公司)，醫(yī)用離心機(BY-320A，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，全自動化學發(fā)光免疫分析儀(UD90DT，北京聯(lián)眾泰克科技有限公司)，全自動包埋機(Tissue-Tek TEC)、全自動脫水機(Tissue-Tek VIP)、全自動染色封片一體機(Tissue-Tek Prisma)均購自日本Sakura公司，全自動石蠟切片機(RM2245，德國Leica公司)，全自動數(shù)字病理切片掃描儀(寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司)；達格列凈(美國Astra Zeneca Pharmaceuticals LP公司，批號：2104240)；高敏心肌肌鈣蛋白T(high-sensitive cardiac troponin T，hs-cTnT)(北京聯(lián)眾泰克科技有限公司，批號：20210722)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的原位缺口末端標記(teminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(批號：MPC2107025)、蛋白酶K(批號：MPC2107048)均購自武漢賽維爾公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及心肌缺血再灌注模型制備 18只新西蘭大白兔按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、達格列凈組，每組6只。模型組參照文獻[10]的方法并進行改良：經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，等待兔的四肢變得松軟，睫毛反射消失后將其固定于實驗動物臺上。連接心電圖機，胸前區(qū)備皮并消毒。沿胸骨左緣尋找第3～4肋間，切開皮膚、皮下組織及部分肌肉，再用小止血鉗進行鈍性分離，注意無氣胸開胸，擦除血跡，如有組織內(nèi)小動脈出血立即給予結(jié)扎。用擴胸器充分撐開以增加手術(shù)視野，用彎頭鑷子夾住胸膜，用眼科剪剪開縱隔胸膜，然后用彎頭鑷子夾持壁層心包，緩慢提起，用眼科剪縱向剪開壁層心包，充分暴露心臟。在手術(shù)野下用兩根棉簽輕輕夾持著心臟并向右側(cè)輕度旋轉(zhuǎn)以充分暴露冠狀動脈的左前降支。用3-0縫合線在兔心臟左前降支中、上1/3交界處穿繞并在其表面平行放置一束線。觀察3～5 min后，記錄心電圖。將縫線穿過心肌，在束線上打兩個活結(jié)，并拉緊兩端，結(jié)扎左前降支。其特點是心電圖V1導聯(lián)出現(xiàn)明顯的ST段抬高，結(jié)扎線以下的心肌明顯發(fā)紺。整個手術(shù)過程中進行心電監(jiān)測。結(jié)扎40 min后，用彎頭鑷提起結(jié)扎處的縫合線和束線，用眼科剪剪斷，恢復(fù)冠狀動脈左前降支血流，使心肌缺血區(qū)進行再灌注120 min。假手術(shù)組在左前降支的下方只穿線，不結(jié)扎；達格列凈組在結(jié)扎前20 min經(jīng)兔耳緣靜脈給予達格列凈0.5 mg/kg，其余步驟均不變。

造模評價：冠狀動脈左前降支結(jié)扎成功的標志是左心室前壁心肌顏色變暗、向外膨脹同時伴V1導聯(lián)心電圖顯示ST段抬高。成功的再灌注的特點是去除結(jié)扎后，心電圖上的ST段抬高減少≥50%。模型組與達格列凈組均造模成功。

1.2.2標本采集 分別于結(jié)扎前、結(jié)扎后40 min、再灌注120 min時從心臟處收集血液1.5 ml，在4 ℃冰箱靜置30 min，以1 610×g離心15 min后收集上清液，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，采用全自動化學發(fā)光免疫分析儀統(tǒng)一檢測血清hs-cTnT水平。

1.2.3心肌組織病理學改變 實驗結(jié)束后，從結(jié)扎線下1 mm的同一區(qū)域提取心肌組織，在10%甲醛溶液中固定，待蘇木精-伊紅染色。石蠟包埋，用石蠟切片機切出厚度為5 μm的切片。切片經(jīng)過脫蠟、水洗、染色、脫水、透明、封片一系列過程后，光學顯微鏡下觀察，并進行拍照。

1.2.4TUNEL法檢測細胞凋亡 在經(jīng)過脫蠟和脫水后，用TUNEL法檢測兔心肌組織切片的凋亡情況，該操作嚴格按照試劑盒說明書進行。凋亡指數(shù)=視野范圍內(nèi)的凋亡細胞數(shù)/視野范圍內(nèi)的所有心肌細胞數(shù)。每個切片在高倍鏡下對5個視野區(qū)域進行計數(shù)，并計算平均值。其中凋亡心肌細胞的細胞核呈深褐色，而正常心肌細胞的細胞核呈藍色。

2 結(jié) 果

2.1兔心肌缺血再灌注過程中心電圖變化 將心電圖機的走紙速度設(shè)置為50 mm/s，定標電壓為10 mm/mV，持續(xù)心電監(jiān)測并記錄單一胸導聯(lián)(將V1導聯(lián)放置于劍突與胸骨柄交界處)心電圖。與結(jié)扎前相比，兔冠狀動脈左前降支結(jié)扎后V1導聯(lián)的ST段迅速呈弓背向上抬高，見圖1a、1b；隨著再灌注時間的延長，ST段逐漸下降，見圖1c。

2.2各組兔血清hs-cTnT水平比較 不同時點間hs-cTnT水平的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，不考慮測量時間，組間hs-cTnT水平的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，組間和時點間存在交互作用(P<0.01)；結(jié)扎前3組hs-cTnT比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)扎后40 min和再灌注120 min，模型組與達格列凈組血清hs-cTnT均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.01)；結(jié)扎后40 min、再灌注120 min，達格列凈組血清hs-cTnT明顯低于模型組(P<0.01)；模型組與達格列凈組血清hs-cTnT均隨著缺血及再灌注時間延長而增加(P<0.01)。見表1。

圖1 兔心肌缺血再灌注過程中心電圖變化 1a為結(jié)扎前，1b為結(jié)扎后，1c為再灌注后

表1 三組兔血清hs-cTnT水平比較

2.3各組兔心肌缺血區(qū)組織病理變化 假手術(shù)組心肌組織蘇木精-伊紅染色表現(xiàn)為心肌細胞染色均勻，顏色深淺一致，心肌纖維排列整齊，細胞間隙正常，未出現(xiàn)心肌細胞壞死，見圖2a。模型組的心肌組織病理改變明顯，心肌細胞染色深淺不一，細胞水腫明顯，排列紊亂，出現(xiàn)嚴重的心肌纖維溶解斷裂，細胞核邊緣模糊顯示不清，見圖2b。達格列凈組心肌細胞紅染較假手術(shù)組略深，心肌纖維排列介于模型組和假手術(shù)組之間，未見嚴重的心肌纖維斷裂現(xiàn)象，細胞核邊緣較為清晰，見圖2c。

圖2 各組兔心肌缺血區(qū)組織病理切片情況 (蘇木精-伊紅染色，×200) 2a為假手術(shù)組，2b為模型組，2c為達格列凈組

2.4各組兔心肌組織凋亡情況比較 假手術(shù)組、模型組、達格列凈組凋亡指數(shù)分別為(10.0±0.9)%、(42.4±1.5)%、(28.6±1.2)%，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=1 014.544，P<0.001),與假手術(shù)組相比，模型組與達格列凈組凋亡指數(shù)均增加(P<0.01)，而與模型組相比，達格列凈組凋亡指數(shù)降低(P<0.01)。在模型組中檢測到大量的凋亡細胞，而達格列凈組的心肌中凋亡細胞數(shù)量明顯減少，見圖3。

3 討 論

再灌注治療對于ST段抬高型急性心肌梗死患者是一種非常重要的治療手段，但同時也是一把“雙刃劍”。當缺血心肌組織再次獲得血液灌注時，可為缺血心肌細胞提供必要的氧氣和營養(yǎng)，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。然而，臨床上一些患者在恢復(fù)血液灌注后器官或組織的缺血性損傷并沒有減少或恢復(fù)，反而進一步加重心肌損傷[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和達格列凈組心肌組織蘇木精-伊紅染色均有明顯的病理改變，表明心肌缺血再灌注過程加劇了心肌損傷。

為了緩解缺血再灌注損傷，Murry等[13]首先提出了缺血預(yù)處理的概念，其可有效減少缺血再灌注損傷。隨后Zhao等[14]提出缺血后處理的方法，多項研究結(jié)果表明，缺血預(yù)處理和缺血后處理均可減小梗死面積，改善心功能[15-17]。然而，缺血預(yù)處理和缺血后處理應(yīng)在創(chuàng)傷的前提下進行，因此，在臨床上并沒有推行。藥理預(yù)處理的優(yōu)點是創(chuàng)傷小、操作簡單，是一種可行的臨床治療方法。已有研究只能說明達格列凈對MIRI合并糖尿病大鼠心肌具有一定的保護作用[18-19]，而對不合并糖尿病的MIRI模型的研究較為少見。因此，本實驗建立了一個與人心肌缺血再灌注相似的、比較成熟的、可重復(fù)的、短實驗周期的兔心肌缺血再灌注模型，觀察達格列凈預(yù)處理對MIRI心肌的影響。

達格列凈是一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑，被廣泛用于心血管和腎臟疾病的細胞保護[20-22]。血清hs-cTnT是心肌損傷時具有高靈敏度和特異度的血清學指標，即使是細微的心肌損傷變化也能檢測出其表達[23]。本研究結(jié)果中，結(jié)扎后40 min、再灌注120 min時，達格列凈組血清hs-cTnT均顯著低于模型組，在一定程度上證實了達格列凈對MIRI的治療作用。目前有關(guān)達格列凈對心肌細胞抗凋亡作用的相關(guān)實驗較少。本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，達格列凈組心肌中的凋亡細胞數(shù)量明顯減少，與以往的研究一致[24]。因此，認為達格列凈對心肌細胞有抗凋亡作用。

綜上所述，達格列凈可以減輕MIRI，對受損的心肌有保護作用。但本實驗僅局限于對心肌結(jié)構(gòu)、心肌損傷特異性標志物及細胞凋亡影響的探討，關(guān)于達格列凈對MIRI心肌的保護作用及具體機制通路有待進一步研究。

注：TUNEL為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的原位缺口末端標記