樺木酸在酸性微環境中對PC-3細胞生物學行為及破骨細胞分化的作用

黃帥 黃國樑 令狐熙濤 謝尚延 瓦慶德 郭遠清 黃彥

1廣州醫科大學附屬第二醫院骨科（廣州 510260）；2遵義醫科大學第二附屬醫院骨科（貴州遵義 563000）；3中山大學附屬第五醫院脊柱外科（廣州 528406）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的以廣泛骨轉移為主要特征的惡性腫瘤之一，近年來我國PCa 發病率也呈逐漸上升趨勢［1-2］。PCa患者一旦并發骨轉移后可引起高鈣血癥、病理性骨折和骨骼劇烈疼痛等多種并發癥［3-4］。PCa 的發生發展與腫瘤酸性微環境密切相關，PCa 細胞在生長與轉移過程中通過掠奪和優先代謝營養物質形成獨特的酸性微環境，進一步促進PCa 細胞的增殖、遷移及干細胞特性等［5-6］。因此，通過降低PCa細胞在酸性微環境中的生長和轉移特性，有望成為一種新的PCa 治療策略。樺木酸（betulinic acid，BA）是一種五環三萜類活性成分，具有顯著的抗瘤活性、調節免疫和抗氧化應激等多種作用，能抑制黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等腫瘤的生長與轉移［8-9］。然而，BA 對PCa 骨轉移的潛在抑制作用尚未見報道。因此，本研究旨在探索BA 在酸性條件下對PC-3 細胞的增殖、遷移、干性及破骨細胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養基、DMEM培養基、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（美國Gibco 公司），樺木酸、MMP 抑制劑GM6001（美國Sigma 公司），重組人表皮生長因子EGF、堿性成纖維細胞生長因子bFGF、B27 添加物、胰島素（美國eBioscience公司），CD31、CD44、α-tublin、MMP-9、E-Cadherin 和RANKL 單克隆抗體（美國CST 公司），ECL 增強化學發光劑（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人前列腺癌細胞株PC-3 和RAW264.7 細胞購于中國科學院細胞庫，分別在含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的1640培養基和DMEM 培養基培養，培養環境均為5% CO2、37 ℃。將微量HCL 和NaOH 溶液加入1640 培養基中并采用滴定法將培養基pH 值調至7.4 和6.5 模擬酸性微環境。

1.2.2 CCK-8 試驗 0.25%胰蛋白酶消化PC-3 細胞后用RPMI 1640 培養基重懸，調整濃度為5×104個/mL 并接種于96 孔培養板中，待細胞貼壁后加入濃度為0、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L 樺木酸溶液，每組5 個復孔。24 h 后加入CCK-8 工作液10 μL，繼續孵育2 h 后通過酶標儀檢測450 nm 處各孔吸光度值，實驗重復3 次。

1.2.3 Transwell 試驗 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L分別處理PC-3細胞，24 h 后胰酶消化重懸，調整細胞數至1 × 106個/mL，然后將200 μL 細胞懸液接種于Transwell上室。并向下室分別加入含MMP 抗體（1∶800）、抑制劑GM6001（0.5 nmol/L）的1640 培養基。繼續培養24 h 后取出Transwell 小室，清除上室細胞，多聚甲醛固定30 min 后結晶紫染色，在顯微鏡下拍照并隨機計數。

1.2.4 黏附試驗 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分別處理6 孔板中PC-3 細胞。24 h 后胰酶消化重懸細胞密度至1× 106個/孔，將細胞懸液接種在FN 包被的96 孔板中，2 h 后用BSA 封閉30 min，PBS 清洗2 次后多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色，拍照計數。

1.2.5 成球試驗 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細胞，然后用無血清1640 培養基（含20 ng/mL bFGF和EGF、1×B27）懸浮細胞至1 × 106個/mL，接種于培養板中繼續培養14 d 計數每孔腫瘤球數。

1.2.6 qPCR 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細胞，24 h 后提取細胞總RNA 并用逆轉錄試劑盒制備cDNA 文庫（樣品為2 μg）。使用實時PCR 試劑盒進行PCR 擴增共40 個循環。以GAPDH 作為對照，通過2-ΔΔCT法計算CD31、CD44 的mRNA 相對表達量。基因引物序列如下：CD31：F 5′-ACATGGCAACAAGGCTGTGTA-3′、R 5′-CCTCAAACTGGGCATCATAAG-3′；CD44：F 5′-ACCCCAACTCCATCTGTGC-3′、R 5′-TTCTGGACATAGCGGGTG-3′；GAPDH：F 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、R 5′-GAAGATGGTG-ATGGGATTTC-3′。

1.2.7 Western blot 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細胞，24 h 后提取總蛋白，BCA 法定量。按30 μg/孔將蛋白樣品加入凝膠中電泳120 min，然后電轉90 min，脫脂奶粉緩沖封閉2 h，洗滌后加入一抗稀釋液CD31（1∶1 000）、CD44（1∶1 000）和α-tublin（1∶1 000）4 ℃封閉過夜。室溫震蕩1 h 后加入相應二抗（1∶2 000），洗膜40 min 后用ECL 試劑盒檢測，實驗重復3 次。

1.2.8 破骨細胞分化試驗及酸性磷酸酶（TRAP）染色 首先在6 孔板中按pH 7.4 組、pH 6.5 組、pH 6.5+ BA 10 μmol/L 組、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 組處理細胞24 h，分別收集上清液后離心5 min，去渣后獲得條件培養基。然后將RAW264.7 細胞接種至6 孔板中，貼壁后分別與條件培養基和RANKL抗體（1∶1 000）共同孵育，7 d 后使用TRAP 試劑盒進行染色。

1.2.9 統計學方法 所有數據用（）表示，統計分析和作圖使用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 軟件，采用t檢驗、單因素方差分析數據，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BA 抑制PC-3 細胞增殖 CCK-8 實驗結果表明與中性pH 7.4（對照組）相比，pH 6.5 酸性微環境促進細胞的增殖，而不同濃度的BA 溶液以濃度依賴性抑制酸性微環境中PC-3 細胞的增殖能力，差異有統計學意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 BA 抑制PC-3 細胞在體外的增殖Fig.1 BA inhibited PC-3 cells proliferation in vitro

2.2 BA 抑制PC-3 細胞遷移 Transwell 試驗結果顯示酸性微環境促進PC-3 細胞的遷移能力，10 μmol/L 和15 μmol/L 的BA 溶液抑制PC-3 細胞的遷移能 力（P＜0.05），與MMP-9 抗體和抑制 劑GM6001 的抑制效應一致（圖2）。

圖2 BA 抑制PC-3 細胞的遷移（×100）Fig.2 BA inhibited migration of PC-3 cells in vitro（×100）

2.3 BA 抑制PC-3 細胞黏附 基質黏附實驗發現酸性微環境能提高PC-3 細胞與基質間的黏附能力，分別在酸性微環境中添加10、15 μmol/L 濃度的BA 溶液和E-Cadherin 抗體后，PC-3 細胞的遷移能力顯著減弱（P＜0.05，圖3）。

圖3 BA 抑制PC-3 細胞的黏附（×100）Fig.3 BA inhibited the adhesion ability of PC-3 cells in vitro（×100）

2.4 BA 抑制PC-3 細胞干細胞特性 成球實驗結果發現PC-3細胞在酸性微環境中的成球能力增強，而10 μmol/L和15 μmol/L的BA則抑制PC-3細胞在酸性微環境中的成球能力（P＜0.05，圖4A-B）。同時BA 顯著下調PC-3 細胞中CD31、CD44 的表達水平（P＜0.05，圖4C-E）。

圖4 BA 抑制PC-3 細胞的干細胞特性（×100）Fig.4 BA inhibited the stem cell property of PC-3 cells in vitro（×100）

2.5 BA 抑制PC-3 細胞誘導的RAW264.7 細胞成骨分化 破骨細胞分化實驗發現酸性微環境能促進PC-3細胞誘導的破骨分化，添加10、15 μmol/L 的BA 溶液后，PC-3 細胞誘導的破骨分化作用顯著減弱（P＜0.05，圖5）。

圖5 BA 抑制PC-3 細胞誘導的破骨細胞生成（×100）Fig.5 BA inhibited the PC-3 cells-induced osteoclastogenesis（×100）

3 討論

酸性微環境與腫瘤生長與轉移密切相關，對PCa 的生長和骨轉移中起著重要作用［10-11］。前期研究中發現pH 6.5 的酸性微環境能增強PC-3 細胞的侵襲、干細胞特征［5］，因此在本研究中繼續用pH 6.5 的培養基作為酸性微環境模擬條件，以探索BA 在酸性微環境中對PC-3 細胞的影響。BA 是一種五環三萜類化合物，其通過誘導細胞凋亡、調節細胞周期和抑制自噬發揮抗瘤、抗炎和抗氧化活性［12-13］。SELVANATHAN 等［14］發現BA 可通過激活AMPK 信號抑制胰腺癌細胞的干細胞特性和EMT 過程。HSIAO 等［15］發現BA 通過靶向NF-κB通路抑制胃癌細胞增殖和遷移。但BA在酸性微環境中對PCa 細胞生長與骨轉移的影響尚不清楚，在本研究中首先通過CCK8 檢測了BA 對PC-3 細胞增殖的影響，結果顯示pH 6.5酸性微環境能增強PC-3細胞的增殖，而BA 則呈濃度依賴性抑制PC-3 細胞的增殖，表明BA具有抑制PC-3細胞生長的活性。

遷移和黏附是腫瘤轉移的兩個關鍵步驟，基質金屬蛋白酶（MMPs）可以通過水解多種細胞外基質成分以促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，E-cadherin蛋白則是介導細胞間黏附的關鍵跨膜糖蛋白［16］。EKANEM 等［17］和ZHANG 等［18］發現過表達MMP2 和MMP9 或下調MMP9 可抑制膠質瘤、卵巢癌細胞的轉移，而E-cadherin的表達異常會改變前列腺癌、肺癌的轉移特性［19］。在本研究中分別采用了Transwell試驗和黏附試驗評估BA 在酸性微環境中對細胞遷移和黏附的影響，結果顯示酸性微環境促進PC-3 細胞的遷移和黏附，而加入10、15 μmol/L 的BA 溶液則顯著抑制PC-3 細胞的遷移和黏附，其抑制效果與使用MMP 抗體、MMP 抑制劑GM6001 和E-cadherin 抗體阻斷MMP 與E-cadherin 一致，提示BA 溶液能通過抑制PC-3 細胞在酸性微環境中的遷移和黏附能力發揮抗PCa 轉移活性。前列腺癌干細胞對PCa 骨轉移的發生起著關鍵作用，消除PCa干細胞是一種潛在的PCa治療策略［20］。本研究采用成球試驗檢測BA 在酸性微環境中對PC-3 細胞成球能力的影響，結果表明pH 6.5 的酸性微環境促進了PC-3 細胞的成球能力，而BA 抑制PC-3細胞的成球能力，同時BA 抑制干性標記基因CD31、CD44 的表達，上述結果證實BA 能抑制酸性微環境中PC-3 細胞的干細胞特性。在PCa 骨轉移過程中，破骨細胞被異常激活并導致骨質破壞從而誘發骨不良相關事件，而阻斷RANKL 分子則能抑制破骨細胞分化，從而改善PCa 骨轉移患者臨床癥狀。在成骨分化實驗中，發現RANKL 抗體對PC-3細胞誘導的成骨分化與酸性微環境中BA溶液誘導結果一致，均能抑制PC-3 細胞誘導的成骨分化，提示BA是一種有效的破骨細胞生成抑制劑。

綜上所述，BA 可以抑制PC-3 細胞在酸性微環境中的增殖、遷移及干細胞特性，同時能顯著抑制PC-3 細胞誘導的破骨細胞分化，上述結果提示樺木酸可能是一種有效的抗PCa 骨轉移活性成分，為后續開發新型抗PCa 藥物提供了前期試驗依據。但其有關的作用機制和體內抑瘤效應尚未探索和驗證，下一步將在本研究結果基礎上更深入的研究BA發揮抗PCa作用的具體機制和體內效果。