黃瓜秸稈協同降解菌群的篩選及其促生效果探究

李欣 張旭 剌世凱 謝鷹飛 陳世君 高麗紅 田永強

（中國農業大學園藝學院，設施蔬菜生長發育北京市重點實驗室，北京 100193）

秸稈是農業生產中主要的廢棄物，也是重要的可再生資源。2020年我國的秸稈產生量為7.71億t，其中包括作物秸稈和蔬菜秸稈。與作物秸稈相比，蔬菜秸稈的營養成分豐富，含水量高，不易燃燒，且容易引發病蟲害（陳慈 等，2021）。雖然我國每年產生的蔬菜秸稈量巨大，但絕大部分被直接丟棄或者露天焚燒，不僅造成資源浪費，而且嚴重污染環境（吳文輝 等，2020）。

將蔬菜秸稈原位還田，能夠有效避免因秸稈離田后處置不當造成的資源浪費和環境污染（陳慈 等，2021；吳文輝 等，2021）。有研究發現，蔬菜秸稈還田后，其腐熟產生的養分可以增加土壤有機質含量，改善土壤質量，并提高作物產量（吳文輝 等，2021）。然而，一些蔬菜（特別是果菜類）秸稈的主要成分是由纖維素、半纖維素和木質素構成的復雜木質纖維素結構，田間降解難度大（Zhang et al.，2021），這不僅導致了秸稈原位還田后難以被充分利用，而且阻礙了蔬菜秸稈還田腐熟的推廣和普及。

微生物通過產生纖維素酶將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖，在秸稈降解過程中發揮了重要作用（Covino et al.，2020）。在自然條件下，秸稈降解是多種微生物協同作用的結果（Qu et al.，2020；Zhang et al.，2021）。近些年，越來越多的研究發 現，純培養分離的單菌株的纖維素降解能力較弱，而將多種纖維素類降解菌混合培養后，纖維素酶的多樣性增加，多種酶協同作用共同提高了秸稈的降解率（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。因此，利用微生物間的協同關系，人工篩選構建一個高效的協同降解菌群是提高秸稈降解效率的重要方式。盡管如此，目前鮮見與蔬菜（特別是果菜類）秸稈協同降解菌群篩選相關的研究報道，實際生產中仍缺乏蔬菜秸稈的專性降解菌劑。值得注意的是，在生產中，除評價篩選的協同降解菌群對秸稈的降解效果外，還應關注菌群是否會對作物生長產生不利影響。

為解決蔬菜秸稈協同降解菌群缺乏及其對作物生長影響不明確的問題，本試驗以黃瓜秸稈為試驗材料，以菜田土壤、優質堆肥、蚯蚓糞和生物炭的混合物作為混合物料，采用專化缺碳培養基篩選了能夠專性降解黃瓜秸稈的高效協同降解菌群，測定了其在黃瓜秸稈降解過程中的相關指標，分析了該協同降解菌群的群落組成和碳源利用特征，并通過種子測試和幼苗測試探究了協同降解菌群對黃瓜生長的影響。此外，分離純化了協同降解菌群的單菌株，并鑒定了其纖維素降解能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種為中農26 號（中國農業科學院蔬菜花卉研究所育成品種）。

磷酸鹽 緩沖液：KHPO0.661 8 g，KHPO0.163 3 g，MgSO0.1 g，NaCl 6.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；液體專化缺碳培養基：MgSO·7HO 0.4 g，KHPO1.323 8 g，KHPO0.326 6 g，CaCl·2HO 0.05 g，FeSO·7HO 0.01 g，MnSO·HO 2.1 mg，ZnSO·7HO 0.25 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；菌源：在100 mL磷酸鹽緩沖液中加入10 g 固體混合物料（由菜田土壤、優質堆肥、蚯蚓糞和生物炭混合而成），于28 ℃和200 r·min轉速條件下振蕩培養1 h 獲得。

1.2 試驗設計

試驗于2018 年6月至2021 年9月在中國農業大學園藝學院設施蔬菜栽培生理與環境調控實驗室進行。

1.2.1 黃瓜秸稈協同降解菌群的篩選 將5 g 黃瓜秸稈剪成3～4 cm 長的小段，裝入125 mL 含有4%（體積比）菌源的液體專化缺碳培養基中，共設置4 次重復，于30 ℃和200 r·min轉速條件下限制性培養15 d。將培養15 d 的混濁菌液作為菌源，取出5 mL 接種到新的液體專化缺碳培養基中，其余的原料和步驟均不變，繼續振蕩培養15 d。如此連續限制性繼代培養10 代以上（＞ 150 d），得到的菌液即為能夠穩定降解黃瓜秸稈的專性高效協同降解菌群。

盡管身價倍增，不過依然有一部分“有錢、任性”的消費者愿意為禮盒包裝的“高顏值”奶糖埋單，或是作為送人的禮品，或是為了滿足自己的“少女心”。

1.2.2 黃瓜秸稈降解特性與協同降解菌群特征測定 吸取5 mL 繼代培養10 代后的協同降解菌群菌液，加入到含有5 g 秸稈的125 mL 液體專化缺碳培養基中繼續繼代培養，將繼代培養0、1、3、6、9、12、15 d 的秸稈用自來水沖洗3～4 次，直至將多余的微生物雜質沖洗干凈，在65 ℃烘箱烘干至恒重，用百分之一天平測定降解前和降解后的秸稈干質量，計算秸稈降解率。

式中和W分別為降解前和降解后的秸稈干質量。

木質纖維素組分采用Goering 和van Soest（1971）的方法測定并計算其降解率：將繼代培養0、1、3、6、9、12、15 d 后烘干的黃瓜秸稈，用打樣機粉碎后過1 mm 篩孔，稱取0.5 g 放入F57專用袋中，用ANKOM220 纖維分析儀（USA）分析纖維素、半纖維素和木質素的含量。

取繼代培養0、1、3、6、9、12、15 d 的秸稈-菌群混合培養液測定其pH、菌液濃度OD和纖維素酶活性。pH 采用電位計法測定。菌液濃度用OD表征，采用紫外可見分光光度計測定。纖維素酶活性（底物為纖維素）采用Ghose（1987）的方法測定。

1.2.3 黃瓜秸稈協同降解菌群的群落組成和碳源利用特征 利用PowerSoil DNA 試劑盒（MoBio Laboratories Inc.，CA，USA）提取協同降解菌群的總DNA，采用NanoDrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，USA）測定其濃度和質量。以提取的DNA 為模板，PCR 擴增后進行高通量測序（Li et al.，2021）。細菌引物為515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′），真菌引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3′）。采用Biolog ECOPLATE（包含31 種單一碳源和1 個水空白）測定微生物碳源利用水平（Fan et al.，2016）。

1.2.4 協同降解菌群中單菌株的分離和鑒定 采用無菌水梯度稀釋協同降解菌群，制成10～10濃度的菌懸液，涂布在添加了制霉素的R2A（Bai et al.，2015）固體培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～4 d。挑取合適的單菌落進行劃線分離，通過4～5 代的劃線純化得到單菌株。挑取分離純化的單菌株制備菌懸液進行菌落PCR，選用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對細菌的16S rDNA 基因序列進行PCR 擴增，將測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，根據同源性在GenBank 中尋找相似性最大菌株的基因序列。使用MEGA 5 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育進化樹，并用Bootstrap 對進化樹進行1 000 次可信度分析。利用高通量測序獲得菌群的群落組成。

1.2.5 純化單菌株的纖維素降解能力測定 挑取分離純化的單菌株于滅菌的R2A 液體培養基中，在28 ℃和200 r·min轉速條件下培養24 h 制備菌懸液，吸取5 μL 菌懸液點斑在剛果紅-纖維素培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察菌落周圍是否有透明水解圈，并用直尺測量水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），每個單菌株設置3 次重復，每個重復1 個皿。

1.2.6 種子測試 將協同降解菌群接種至液體專化缺碳培養基中，在30 ℃和200 r·min轉速條件下培養，直至菌懸液在600 nm 處的吸光值（OD）大于1.0，用無菌水將菌懸液稀釋成OD值分別為0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 的不同濃度（分別簡稱為OD 0.2、OD 0.4、OD 0.6、OD 0.8 和OD 1.0）。將表面消毒的黃瓜種子（75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 次，3%次氯酸鈉浸泡8 min，無菌水沖洗6 次）置于不同OD值的菌懸液中浸泡8 h，以無菌水為對照（CK），將浸泡后的種子置于鋪有雙層無菌濾紙的培養皿中，每皿6 粒，分別加入7 mL無菌水，在28 ℃和70%～80%相對濕度條件下培養。試驗共6 個處理，每個處理5 次重復，每個重復1 個皿。

培養3 d 后統計黃瓜種子的發芽率，用萬分之一天平測定鮮質量。采用EPSON EXPERSSION 4900 型掃描儀掃描黃瓜種子苗根系，然后用Win RHIZO 軟件進行分析，獲得總根長、根體積、根表面積。采用Image J 測定胚軸長和莖長。統計種子活力指數。

采用EPSON EXPERSSION 4900 型掃描儀掃描黃瓜幼苗根系和葉片，然后用Win RHIZO 軟件進行分析，獲得總根長、根體積、根表面積、根尖數和最大真葉的葉面積。采用直尺測量株高，采用數碼游標卡尺測量莖粗，采用直接計數法統計葉片數，采用SAPD 儀測定最大真葉的葉綠素含量。

將黃瓜幼苗的地上部和地下部自莖底端分開后，分別用萬分之一天平測定鮮質量，然后在105 ℃的烘箱中殺青30 min 后，85 ℃烘干直至恒重，再測定干質量。

式中TDW、SDW 和RDW 分別表示全株干質量、地上部干質量和地下部干質量，PH 和SD 分別表示株高和莖粗（Sun et al.，2020）。

1.3 數據統計與分析

采用EXCEL 2016 和SPSS 23.0 軟件對試驗數據進行統計分析及方差分析，采用Tukey’HSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 黃瓜秸稈的降解特性與協同降解菌群的特征

黃瓜秸稈的降解率、木質纖維素含量及秸稈-菌群混合培養液的OD、pH、纖維素酶活性的變化如圖1 所示。在15 d 的培養過程中，秸稈干質量在培養0～6 d 迅速下降，6 d 時秸稈降解率達到73.3%；此后，秸稈干質量的下降速率變慢，培養15 d 時秸稈降解率為80.7%。木質纖維素組分（特別是纖維素）含量隨培養時間的變化趨勢與黃瓜秸稈干質量基本一致。培養15 d 時，協同降解菌群對纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別是78.8%、74.7%和49.4%。表明協同降解菌群能夠通過降解木質纖維素組分有效降解黃瓜秸稈。

圖1 黃瓜秸稈降解特性與協同降解菌群特征隨時間的變化

在降解黃瓜秸稈的過程中，協同降解菌群與秸稈的混合培養液pH 在0～12 d 持續上升，且0～1 d 的上升速率最快，培養12 d 時達最高（8.79），隨后開始下降。培養液pH 的上升可能是由于在協同降解菌群降解黃瓜秸稈的過程中產生了堿性物質所致。OD反映了培養液中微生物的密度。在協同降解菌群降解黃瓜秸稈過程中，其OD在培養1 d 后便急劇增加，此后平穩上升并于培養6 d 后達到最大值（2.192），隨后開始緩慢下降。這說明，當以黃瓜秸稈為唯一碳源時，協同降解菌群在短期內（＜ 1 d）就能迅速大量繁殖并降解大部分黃瓜秸稈。與OD的變化特征相似，纖維素酶活性在培養0～9 d 呈現上升趨勢（其中0～6 d 上升迅速），培養9 d 后達到酶活性高峰（0.110 4 IU），此后呈緩慢下降趨勢。

綜上所述，黃瓜秸稈協同降解菌群的生長繁殖情況與秸稈干質量、木質纖維素組分含量、培養液pH 和纖維素酶活性的變化具有一致性和關聯性：培養0～6 d 協同菌群繁殖迅速，pH 和纖維素酶活性迅速上升，而秸稈干質量及纖維素、半纖維素、木質素的含量迅速減少，使得秸稈降解率迅速上升；后期協同降解菌群生長緩慢，各個指標的變化趨勢也相應變緩。

微生物碳源利用水平可以反映秸稈降解過程中微生物對不同碳源的利用程度。由表1 可知，協同降解菌群可以利用31 種碳源中的23 種，只有8種（L-Arginine、i-Erythritol、2-Hydroxy Benzoic Acid、4-Hydroxy Benzoic Acid、α-Cyclodextrin、Glycogen、Itaconic Acid 和α-Keto Butyric Acid）不能被利用。從六大類碳源物質水平上看，黃瓜秸稈協同降解菌群可以利用碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、酰胺/胺類和聚合物類的絕大部分。總體來看，黃瓜秸稈協同降解菌群的碳源利用多樣性較高但具有一定的特異性，因本試驗是以黃瓜秸稈為唯一碳源進行篩選，由此推測黃瓜秸稈中只含有碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、酰胺/胺類和聚合物類五大類碳源物質。

表1 協同降解菌群的碳源利用特征

2.2 黃瓜秸稈協同降解菌群的群落組成和單菌株特性

在門水平下，協同降解菌群的優勢群落（相對豐富度＞ 1%）為擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、異常球菌門（Deinococcota）、放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、髕骨細菌門（Patescibacteria）和蛭弧菌門（Bdellovibrionota）等8個門。優勢群落的占比達到97.88%，其中擬桿菌門占比最高，達64.36%（圖2-A）。在屬水平下，協同降解菌群的優勢群落（相對豐富度＞ 1%）為、、、、、、、、、、和等12 個屬，在整個群落中占比達到97.88%（圖2-B）。

圖2 協同降解菌群的群落組成和分離單菌株的系統發育樹

從協同降解菌群中分離出33 個單菌株，基于16S rDNA 測序和BLAST 同源性比對構建了系統發育樹（圖2-C）。絕大多數的菌株與相似性最高的菌株同源性≥ 97%，但是菌株2-7 和4-24 與相似性最高的菌株同源性分別只有94%和95%（屬于新種屬）。絕大多數菌株分別屬于、、、、、、，、、、、、、、、、、、、、、和。

在剛果紅-纖維素培養基上產生水解圈表明單菌株具有降解纖維素的能力，水解圈直徑與菌落直徑比值（D/d）的大小可表示菌株降解纖維素能力的強弱。本試驗共篩選出33 個單菌株，其中有15個單菌株產生水解圈，具有降解纖維素的能力（表2）。其中編號1-3 和5-33 的2 個菌株降解能力明顯高于其他菌株。由此可知，在黃瓜秸稈協同降解菌群中，并非所有的菌株都具有降解纖維素的能力，其他的菌株可能發揮協同降解的間接作用或者參與下一步的物質分解。

表2 協同降解菌群中單菌株的纖維素降解能力

2.3 黃瓜秸稈協同降解菌群對黃瓜生長的影響

種子苗鮮質量、根長和活力指數是反映種子苗生長狀況的重要指標。不同OD的協同降解菌群對黃瓜種子苗鮮質量和根系相關指標的影響如圖3 所示。當OD為0.4 和0.6 時，協同降解菌群會顯著增加黃瓜種子苗的鮮質量，較CK 分別提高13.4%和16.0%。協同降解菌群對黃瓜種子苗的胚軸長無影響，但在OD為0.6 和1.0 時顯著提高了總根長，較CK 分別提高14.6%和21.2%。在所有OD處理下，協同降解菌群對黃瓜種子苗根體積和根表面積無顯著影響。雖然協同降解菌群在OD為0.6 和1.0 時顯著提高了種子的活力指數，但OD達到0.4 后所有OD處理間均無顯著差異。綜上所述，當協同降解菌群的OD達到0.4時，能夠增加種子苗鮮質量、總根長和活力指數，對黃瓜種子苗具有很好的促生作用。

圖3 協同降解菌群對黃瓜種子苗生長的影響

株高、莖粗、葉片數、最大葉面積和葉綠素含量是反映幼苗地上部生長發育的重要指標。不同OD的協同降解菌群對黃瓜幼苗生長的影響如圖4。除OD 0.2 外，其他OD處理下的株高和莖粗均顯著高于CK，且各處理間的株高和莖粗無顯著差異。黃瓜幼苗的葉片數、最大葉面積、地上部鮮質量和地上部干質量在OD處理間表現出了與株高和莖粗相似的趨勢。表明當OD達到0.4 時，協同降解菌群就能夠對黃瓜幼苗地上部生長起到明顯的促進作用。但是，所有OD處理的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量均顯著低于CK，這可能是因為協同降解菌群處理下葉片生長快，其葉面積擴張使得葉綠素含量相對較低。由于OD達到0.4 后，所有OD處理下協同降解菌群顯著增加了幼苗地上部的鮮質量和干質量，說明雖然OD處理的幼苗葉片葉綠素含量低，但并未對植物光合產生不利影響。總根長、根體積、根表面積和根尖數是反映黃瓜幼苗地下部生長情況的重要指標。除了OD 0.2和OD 0.8，其他濃度的菌液均顯著促進了總根長的增加，其中OD 0.4 的總根長增加最多，比CK 增加了57.3%。所有OD處理下的協同降解菌群均顯著增加了根體積，且OD達到0.4 后顯著增加了根表面積。值得注意的是，與CK 相比，僅OD 0.4處理顯著增加了幼苗根尖數，增幅為79.0%；地下部鮮質量最大值也出現在OD 0.4 處理中。鮮質量和干質量是幼苗葉片光合和根系吸收水分與營養物質綜合作用的結果，壯苗指數反映了幼苗的整體質量，是對幼苗質量進行綜合評判的關鍵指標。整體來看，當OD達到0.4 后，所有OD處理間的幼苗鮮質量、干質量和壯苗指數均顯著高于CK，且各OD處理間的干質量和壯苗指數無顯著差異。綜合考慮，當OD達到0.4 時，協同降解菌群能夠對黃瓜幼苗地下部生長和整體質量起到明顯的促進作用。

圖4 協同降解菌群對黃瓜幼苗生長的影響

3 討論與結論

大量研究表明，多菌株混合培養對秸稈的降解效果顯著優于單菌株，不同菌株會分泌不同的纖維素酶系，多個酶系協同作用共同加快秸稈的降解（郭夏麗 等，2010；Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。本試驗篩選的協同降解菌群能夠高效降解黃瓜秸稈（圖1），且對纖維素、半纖維素和木質素的降解率高于前人（Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021）的研究結果。這主要是因為本試驗以黃瓜秸稈為唯一碳源，采用專化缺碳培養基經過持續繼代直接篩選協同降解菌群，而不是用單菌株人工構建復合菌群，有利于保持不同菌株的自然協同關系，避免菌株間產生拮抗作用。雖然前人報道了較多的人工組裝復合菌系（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019；Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021），但相關研究基本都是針對大田作物秸稈，而鮮見關于蔬菜秸稈協同降解菌群的研究報道。

瓜類作物秸稈的組成結構與糧食作物秸稈（如水稻秸稈、玉米秸稈等）明顯不同，其養分含量較高，且組成比糧食作物秸稈更復雜。降解纖維素類物質的酶類是一組酶，其相互配合、協同作用，最后表現為秸稈降解率的提升。本試驗篩選獲得的黃瓜秸稈協同降解菌群在門、屬水平下種類豐富，優勢群落既包括擬桿菌、變形菌、放線菌和厚壁菌等常見菌屬，也包括異常球菌、疣微菌、髕骨細菌和蛭弧菌等稀有菌屬（圖2-A、2-B）。由于本試驗的協同降解菌群對纖維素、半纖維素和木質素的降解率都相對較高（圖1），因此推斷自然篩選的協同菌群更有利于發揮不同菌株間的協同作用，同時有利于保持菌群的穩定性。本試驗從黃瓜秸稈協同降解菌群中分離出的33 個單菌株中有近一半（15 個）的單菌株具有降解纖維素的能力，說明有些菌株雖然沒有分解纖維素的能力，但是可能參與秸稈降解的后續物質變化過程或者維持協同菌群的穩定性。需要注意的是，不同菌株纖維素的降解圈只能表明對該底物的降解能力，而對自然界中復雜底物的降解率與不同纖維素降解菌所產生的分解酶的配比、活性及適宜底物、所在環境條件都有關聯。

種子試驗和幼苗試驗均表明，當黃瓜秸稈協同降解菌群的OD達到0.4 時，就能夠對黃瓜種子苗和幼苗生長及質量相關指標起到明顯的改善效果（圖3、4）。當協同降解菌群OD超過0.4 時，對黃瓜種子苗和幼苗的促生效果并沒有進一步增加，表明此密度的降解菌群已占領了種子根系的最大表面積和有效位點，并發揮最大效能。因此，本試驗篩選的協同降解菌群不僅能夠高效降解黃瓜秸稈，而且對黃瓜生長有促進作用。根據前人的研究報道，能夠起到促根壯秧效果的微生物種類繁多，如（Kloepper et al.，2004）、（Fu et al.，2017）、（Hu et al.，2019）和（Prathibha &Siddalingeshwara，2013）等，而這些菌也正是本試驗篩選獲得的能夠協同降解黃瓜秸稈的菌種（圖2-C）。

總體來看，本試驗基于自然協同的原理篩選獲得的協同降解菌群不僅能夠高效降解黃瓜秸稈，而且對黃瓜生長有明顯的促進效果。采用較低濃度（OD=0.4）的菌懸液，即可獲得較好的促生 效果。