生防鏈霉菌PBSH9對馬鈴薯瘡痂病菌的抑制作用及其代謝物培養條件優化

王麗瑋 萬中義 宋亞迪 修志君 于世成 杜美娥 張笑宇*

（1 內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，內蒙古呼和浩特 010019；2 湖北省生物農藥工程研究中心，湖北武漢 430070；3 鄂爾多斯生態環境職業學院，內蒙古鄂爾多斯 017010）

馬鈴薯（L.）是一種重要的全球性作物，在國內外大面積種植，其種植面積僅次于水稻、小麥和玉米，在經濟發展中發揮著重要的作用。2018 年全球馬鈴薯產量約為3.68 億t，我國馬鈴薯總產量達9 000 萬t，成為馬鈴薯產量第一大國（Liu et al.，2020；Li et al.，2021）。

馬鈴薯瘡痂病（potato common scab）是由多種植物病原鏈霉菌（spp.）引起的世界范圍內重要的土傳病害，被稱為馬鈴薯第四大病害，發生日趨嚴重（Chi et al.，2021），給全世界各馬鈴薯產區帶來了嚴重威脅（Dees &Wanner，2012）。馬鈴薯感染瘡痂病菌后，在塊莖表面形成木栓狀隆起、凹陷或平狀病斑（Kinga &Calhoun，2005），對馬鈴薯的品質造成影響，降低其經濟價值。在美國，瘡痂病是馬鈴薯五大病害之一（Wanner，2009）。加拿大82%的馬鈴薯生產區都會發生馬鈴薯瘡痂病，每年因該病害造成的經濟損失在1 530 萬～1 730 萬美元之間（Hill &Lazarovits，2005）。我國多個省份報道有該病的發生（杜魏甫，2016），在內蒙古自治區，馬鈴薯瘡痂病的發生尤為嚴重，商品田發生面積達16.6 萬hm，種薯田發生面積為0.07 萬hm（張建平 等，2018），一些馬鈴薯微型薯種植區的發病率已高達90%（梁宏杰 等，2021）。尋找一種綠色高效的瘡痂病防治方法，成為了馬鈴薯產業亟待解決的問題。

使用抗病品種是馬鈴薯瘡痂病最經濟有效的防治措施，但是抗瘡痂病的馬鈴薯品種較少，且未發現對瘡痂病菌具有完全抗性的品種（Dees &Wanner，2012）。有的采用輪作和降低土壤pH 值的方法，但效果不理想（陳利達 等，2020）；化學防治在一定程度上可減輕該病害的發生，但不能達到徹底防治的目的，使用不當還會產生副作用（李爽 等，2018；Yang et al.，2021）；生物防治不會造成環境污染和毒素殘留，可連續持久地控制該病害（Alamri et al.，2012）。近年來的研究結果表明，生防菌芽孢桿菌（spp.）對馬鈴薯瘡痂病有明顯的防治效果，包括側孢芽孢桿菌（）（Chen et al.，2017）、解淀粉芽孢桿菌（）（Lin et al.，2018）和高地芽孢桿菌（）（Li et al.，2019）等。此外，一些非致病鏈霉菌也可有效地防治馬鈴薯瘡痂病，如玫瑰黃鏈霉菌（）Menmyco-93-63 發酵液與蛭石混合后對馬鈴薯瘡痂病的防效為49.02%（許華民，2015）；橄欖色鏈霉菌（）和褶皺鏈霉菌（）也被報道具有抗馬鈴薯瘡痂病菌的活性（Zadeh et al.，2006）。

內蒙古農業大學植物病理學課題組前期從馬鈴薯瘡痂病病斑上分離到1 株生防鏈霉菌PBSH9，經鑒定為鏈霉菌的1 個新種（Zhang et al.，2020），命名為sp.nov.（登錄號：JAKZEO000000000）。本試驗研究該生防菌及其代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌形態的影響，并用單因素試驗優化PBSH9 的發酵條件，為該生防菌的研發和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

生防鏈霉菌PBSH9（sp.nov），馬鈴薯瘡痂病菌加利利鏈霉菌PS1（），均由內蒙古農業大學植物病理實驗室分離保存。

1.2 培養基

高氏1 號培養基：MgSO·7HO 0.5 g、FeSO·7HO 0.01 g、KNO1 g、NaCl 0.5 g、KHPO0.5 g、淀粉20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下滅菌30 min。

ISP培養基：葡萄糖4 g、酵母浸粉4 g、麥芽浸粉10 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下滅菌30 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1的抑制作用 2021 年6月利用平板對峙法評價菌株PBSH9 對病原菌PS1 的抑制作用。將PS1 置于液體ISP培養基中28 ℃振蕩培養2 d，使其菌懸液濃度為1 × 10cfu·mL，再取200 μL 菌懸液均勻涂在ISP固體培養基上，用直徑為5 mm 的無菌打孔器取菌株PBSH9 菌餅，倒置于涂有PS1 的ISP固體培養基平板中央，以沒有菌的固體培養基作對照，設置5 個重復，28 ℃培養3 d，觀察抑菌效果。將菌株PBSH9連續培養3 代，用相同的方法觀察PBSH9 對PS1 抑制效果的穩定性，十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑制率，并在光學顯微鏡下觀察PS1 的菌絲和分生孢子形態變化。

1.3.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用 將菌株PBSH9 接種在固體高氏1 號培養基上，28 ℃下培養3 d，取2 個直徑為5 mm 的菌餅，置于80 mL 液體高氏1 號培養基中，180 r·min、28 ℃恒溫下振蕩培養。從0 h 開始每隔12 h 取樣測定菌液在波長為600 nm 處的吸光值（OD），繪制生長曲線，確定PBSH9 對數生長期，并以此時期的菌懸液作為后續培養試驗的種子液。每組試驗3 次重復。

每100 mL 液體高氏1 號培養基中接入5 mL OD在1.189 左右的PBSH9種子液，28 ℃振蕩培養5 d，10 000 r·min離心10 min，取上清液，再用孔徑為0.22 μm 的過濾器將其過濾，得到PBSH9 代謝物，置于滅菌的離心管中，4 ℃保存 備用。

以打孔法檢測代謝物的抑菌活性。向直徑為90 mm 的培養皿中倒入20 mL 固體ISP培養基，待培養基凝固后取200 μL 病原菌PS1（1 × 10cfu·mL）菌液均勻地涂在培養基表面，用滅菌的打孔器在距離平板中央2 cm 處分別打3 個直徑為5 mm的孔，向孔中分別注入菌株PBSH9 的代謝物、125 μg·mL氯霉素（陽性對照，CK1）、液體高氏1號培養基（空白對照，CK2）各100 μL。3 次重復。28 ℃恒溫培養2 d，十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑制率。同時在光學顯微鏡下觀察PS1 的菌絲和分生孢子形態。

1.3.3 生防鏈霉菌PBSH9 培養條件的優化 ①培養時間及接種量對PBSH9 抑菌活性的影響。在100 mL 液體高氏1 號培養基中，分別接入OD約為1.189 的PBSH9 種子液3、5、7、9 mL，180 r·min、28 ℃條件下振蕩培養1～12 d，每隔24 h 取1 次樣，10 000 r·min條件下離心10 min 后用孔徑為0.22 μm 的過濾器過濾得到代謝物，置于滅菌的離心管中，4 ℃保存備用。按照1.3.2 的方法在涂有病原菌PS1 的固體高氏1 號培養基上打孔，每個孔中接入100 μL 代謝物，28 ℃恒溫培養3 d。以抑菌圈直徑判斷最優培養時間及接種量。每組試驗3 次重復。

② 培養溫度對PBSH9 抑菌活性的影響。在100 mL 液體高氏1 號培養基中接入7 mL PBSH9 種子液，轉速為180 r·min，設置溫度梯度為22、25、28、31 ℃和34 ℃，分別振蕩培養9 d，按照①中的方法獲得代謝物并用打孔法判斷最優培養溫度。每個處理3 次重復。

③培養基pH 對PBSH9 抑菌活性的影響。調節液體高氏1 號培養基的pH 為4～12，每個pH 梯度分別接入7 mL PBSH9 種子液，180 r·min、28 ℃條件下振蕩培養9 d，按照①中的方法獲得代謝物并用打孔法判斷最優培養pH。每個處理3次重復。

1.4 數據分析

試驗結果利用Excel 2010 軟件進行統計分析，統計結果利用SPSS 20.0.0分析軟件進行數據分析，并檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

PBSH9 對病原菌PS1 具有顯著的抑制作用，培養3 代的抑制率均大于70%，一代、二代、三代的抑制率分別為74.79%、74.13%、75.00%，抑制效果穩定，三者間無顯著差異。由圖1 可知，PBSH9 對PS1 菌絲有明顯的致畸作用，氣生菌絲與基內菌絲都會出現生長畸形的情況，菌絲發生交聯，基內菌絲交聯尤其嚴重（圖1-E、1-F）；氣生菌絲變短、由彎變直、明顯膨脹變粗，且菌絲出現斷裂，原生質滲漏（圖1-E）。此外，PBSH9 會使PS1 的孢子變形，產孢數量降低。共培養24 h 時，與對照（圖1-G）相比，孢子變小且數量明顯減少（圖1-H）。

圖1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的影響

2.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

2.2.1 生防鏈霉菌PBSH9 的生長曲線 如圖2 所示，PBSH9 在液體高氏1 號培養基中培養，培養0～24 h 為菌株緩慢增長期；培養36～72 h 菌株生長速度最快，為對數生長期；72 h 后菌液OD值趨于穩定，菌株生長處于穩定期。

圖2 生防鏈霉菌PBSH9 的生長曲線

2.2.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用 由圖3 可見，PBSH9 代謝物對病原菌PS1 有較強的抑制作用，平均抑菌圈直徑20.17 mm，抑制率為75.21%，顯著高于陽性對照氯霉素對PS1 的抑制率59.45%（平均抑菌圈直徑12.33 mm）。由圖4 可知，經PBSH9 代謝物處理后，PS1 的菌絲畸形，膨脹變粗、變短，出現嚴重的交聯、斷裂，產孢量降低，孢子由圓形變為水滴狀。經氯霉素處理的PS1 菌絲也會畸形，與PBSH9 代謝物處理相比菌絲會更粗，有少數菌絲會斷裂，孢子變為梭形，中間粗，兩端較細。此外，PBSH9抑制了PS1 的菌絲生長，在透明抑菌圈內可以觀察到少量的PS1 孢子，將抑菌圈內的孢子轉移到新的ISP培養基中培養2 d，發現有菌落長出，說明抑菌圈內的孢子仍有活性（圖5）。

圖3 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

圖4 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的影響

圖5 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對抑菌圈內馬鈴薯瘡痂病菌PS1 孢子的影響

2.3 生防鏈霉菌PBSH9 培養條件的優化

2.3.1 培養時間及接種量對生防鏈霉菌PBSH9 代謝物抑菌活性的影響 不同培養時間及接種量都會對PBSH9 代謝物的抑菌效果產生影響（表1），當PBSH9 種子液接種量為3 mL 時，培養9 d 的代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為22.67 mm；接種量為5 mL 時，培養3 d 和4 d 的抑菌圈不清晰，但較大（圖6），培養5 d 時，抑菌圈內無菌絲生長，對病原菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑為19.83 mm；接種量為7 mL、培養9 d 和10 d 時代謝物的抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為24.00 mm 和23.17 mm；接種量為9 mL、培養6 d 和7 d 時抑菌圈直徑分別為20.50 mm 和19.83 mm。綜合比較，每100 mL 液體高氏1 號培養基中接入7 mL 種子液，培養9 d 時代謝物的抑菌效果最好。

圖6 接種量為5 mL 培養3 d（左）和4 d（右）時生防鏈霉菌PBSH9 的抑菌活性

表1 培養時間及接種量對生防鏈霉菌PBSH9 代謝物抑菌圈直徑的影響 mm

2.3.2 培養溫度對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響 當培養溫度為28 ℃時PBSH9 代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，為23.67 mm。溫度升高或降低，其抑菌活性都有所下降（圖7）。

圖7 培養溫度對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響

2.3.3 培養基pH 對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響 由圖8 可知，PBSH9 在培養基pH 為4～12的范圍內都可生長，當pH 為7 時，PBSH9 代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，為23.67 mm。酸性和堿性培養條件下抑菌活性都有所下降。

圖8 培養基pH 對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響

3 討論

瘡痂病在世界范圍內給馬鈴薯生產造成了嚴重的經濟損失，在眾多的防治措施中，生物防治備受學者關注。非致病鏈霉菌屬于土壤習居菌，能在致病鏈霉菌存在的地方生存，因此作為生防菌具有一定的優勢（楊冰 等，2021）。Kobayashi 等（2012）從野生燕麥栽培地分離出的鏈霉菌sp.WoRs-501 對馬鈴薯瘡痂病菌有較強的抑制作用，與干土混合后可使病害嚴重程度降低78%～94%。劉萍萍（2016）發現鏈霉菌sp.CC5 可以抑制馬鈴薯瘡痂病菌的生長，抑菌圈大小為10.5 mm，經紫外誘變后，該鏈霉菌的抑菌作用提高了25%，且經過傳代培養10 代后，抑菌作用沒有減弱。本試驗中生防鏈霉菌PBSH9 也可抑制馬鈴薯瘡痂病菌的生長，傳代培養3 代，對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果穩定。

生物防治的機制主要是利用微生物種內或種間的競爭、溶菌、抗生、重寄生等作用，也有一些是通過合成次級代謝產物來誘導植物產生抗病性，同時促進植物生長。抗菌活性物質通常是拮抗放線菌發揮生物學作用的基礎，而鏈霉菌具有較高的天然產物生物合成能力，因生產抗生素而聞名（Chater，2006；Nett et al.，2009）。Sarwar 等（2018）發現鏈霉菌A1RT 的甲醇提取物對馬鈴薯瘡痂病菌表現出較高的抑菌活性，抑菌圈直徑為26 mm。同時該團隊還從紫黑鏈霉菌AC12AB 中發現了阿扎霉素RS-22A，使馬鈴薯瘡痂病的發病率降低83%，馬鈴薯產量增加26.8%（Sarwar et al.，2019）。Eckwall 和Schottel（1997）從strain PonSSII 中發現了1個只對馬鈴薯瘡痂病菌有抑制作用的分子量在500 左右的化合物。本試驗中，生防鏈霉菌PBSH9 的代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 也具有明顯的抑制作用，平均抑菌圈直徑為20.17 mm，今后有必要對該菌活性物質進行進一步研究。

莽春霞（2016）在研究灰色鏈霉菌（）對煙草靶斑病菌（Kühn）的抑制作用時發現，煙草靶斑病菌被抑制后，菌絲會出現節間變短、變粗、扭曲變形、菌絲分隔增多等現象。本試驗中，利用生防鏈霉菌PBSH9 及其代謝物抑制馬鈴薯瘡痂病菌PS1 時，被抑制的病原菌菌絲也會出現交聯、變粗和斷裂等畸形現象。

抑菌活性物質的產率決定抑菌效果，發酵是獲得大量微生物活性代謝產物的基礎（Duan et al.，2020）。邸墊平等（2006）從玫瑰黃鏈霉菌Menmyco-93-63 的代謝產物中分離具有抑制馬鈴薯瘡痂病菌的化合物時，發酵7 d 就進行萃取分離。戴蓬博等（2016）利用極長鏈霉菌（）SL01 代謝產物防治蘋果樹腐爛病（Miyabe et Yamada）時，50 mL 液體培養基中只接入1 mL 培養3 d 的種子液，發酵培養7 d 后的代謝物就可對蘋果樹腐爛病菌有較強的抑制效果。項仁鑫等（2018）在30 mL 培養基中接入1.5 mL生長32 h 的種子液，發酵7 d，鏈霉菌HY6-S36 的星孢菌素產量最高。不同接種量對代謝物抑菌活性的影響較大，主要是因為接種量較小時，會影響菌株的生長繁殖速度，而接種量過大，會引起搖瓶內溶氧不足，間接影響菌株生長，這兩種情況都會導致菌株次級代謝產物含量降低，最終影響代謝物的抑菌效果（周躍慧，2018）。基于此原因，本試驗中不同接種量的代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌表現出了不同程度的抑制作用。此外，菌株PBSH9 在培養72 h 后處于生長穩定期，但接入7 mL 種子液、培養9 d 時代謝物的抑菌效果最好。雖然從生產角度來說培養9 d 浪費大量資源，生產成本顯著增加，但3 d 與9 d 的代謝物抑菌效果差異顯著，因此確定培養周期為9 d。不同研究得出的結論不盡相同，可能和不同菌株有關，也可能與培養條件等多種因素有關，還需進一步研究，為該菌株的應用奠定基礎。

4 結論

生防鏈霉菌PBSH9 及其代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 有明顯的抑制作用，菌株傳代培養3 代對PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果穩定；PBSH9代謝物的平均抑制率為75.21%。該生防菌及其代謝物使病原菌菌絲發生交聯，變短，變粗，孢子變形，產孢量明顯減少，但透明抑菌圈內的少量孢子仍有活性。每100 mL 液體高氏1 號培養基中接入7 mL OD在1.189 左右的生防菌PBSH9 種子液，調節培養基的pH 為7，轉速為180 r·min、28 ℃下恒溫培養9 d 得到的代謝物抑菌效果最好，抑菌圈直徑為23.67 mm。