黃芪多糖對脂多糖誘導腸上皮細胞IPEC-J2氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的緩解作用

崔海燕，紀龍翔，朱宇晴，李衛(wèi)國

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

腸道是集消化、吸收、內(nèi)分泌、免疫和防御功能于一體的器官.腸道黏膜屏障是阻止外界環(huán)境中有害物質(zhì)侵入機體的一道天然屏障.當腸道炎癥發(fā)生時，會引起腸粘膜壞死、通透性增加以及腸粘膜屏障功能降低[1].脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，LPS刺激可破壞豬腸道上皮細胞間的緊密連接，損壞腸道的完整性而引發(fā)疾病[2].黃芪是一種傳統(tǒng)的補益中藥，含有黃酮類和皂苷等生物活性成分，其中黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，ASP)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能[3].已有研究大多關(guān)注ASP的抗炎作用，關(guān)于ASP對LPS誘導IPEC-J2氧化應(yīng)激和炎癥的保護作用研究較少.本研究通過建立豬腸道上皮細胞LPS損傷模型，探討ASP對LPS刺激IPEC-J2的細胞活力、抗氧化相關(guān)指標及炎癥相關(guān)基因表達的影響，以期為ASP的抗炎作用機制以及在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪多糖(質(zhì)量分數(shù)>90%)購自北京索萊寶生物有限公司，脂多糖(LPS)購自Sigma-Aldrich公司.高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司.超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)購自南京建成生物工程研究所.白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自武漢酶免生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組

豬空腸上皮細胞IPEC-J2系由河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院饋贈.IPEC-J2細胞培養(yǎng)液為質(zhì)量分數(shù)10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，并放在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).將原裝LPS粉末溶解在磷酸鹽緩沖液中，配成1 g/L母液.ASP和LPS均采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.2MTT法檢測LPS和ASP對IPEC-J2細胞活力的影響

取對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，胰酶消化后以每孔1×104cells接種到96孔板中，每孔加100 μL細胞懸液.培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入不同質(zhì)量濃度LPS(0,0.5,1.0,10.0和100.0 mg/L)和ASP(0,12.5,25.0,50.0,100.0和200.0 mg/L)，每組6個重復.之后向每孔中添加10 μL噻唑藍(MTT)溶液(5 g/L)，孵育4 h.小心除去上清液，每孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解.震蕩10 min充分混勻后用酶標儀檢測490 nm波長和參考波長630 nm下的吸光度值.細胞存活率=(A實驗孔490-A實驗孔630)/(A對照孔490-A對照孔630).

1.2.3ASP對IPEC-J2細胞SOD和CAT酶活力及MDA含量的影響

取對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，胰酶消化后以每孔5×105cells在6孔板中培養(yǎng)細胞，每孔加2 mL細胞懸液.培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，按以下分組進行處理：空白對照組,LPS處理組,ASP處理組,ASP+LPS處理組.LPS組表示只加10.0 mg/L LPS處理12 h，ASP組表示只加100.0 mg/L ASP處理4 h，ASP+LPS組表示先用100.0 mg/L ASP處理4 h后再用10.0 mg/L LPS處理12 h，每組3個復孔.處理相應(yīng)時間后收集細胞，然后按照相應(yīng)試劑盒的實驗步驟測定各處理組SOD,CAT酶活力及MDA含量.

1.2.4ELISA法檢測細胞上清液中IL-6,IL-8,TNF-α的含量

取對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，用胰酶消化后以每孔5×105cells在6孔板中培養(yǎng)細胞，每孔加2 mL細胞懸液，培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，經(jīng)過上述對照組,LPS組,ASP組,ASP+LPS組4個處理細胞后，分別收集細胞上清液后按照相應(yīng)試劑盒說明書測定其IL-6,IL-8和TNF-α含量，之后向每孔加入1 mL Trizol裂解細胞，-80 ℃保存.

1.2.5實時定量PCR檢測細胞IL-6,IL-8,TNF-α和IL-10基因的相對表達量

按照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)法提取RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?采用TB GREEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本)生成cDNA.PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性300 s，之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s和72 ℃ 20 s，35個循環(huán).所有引物均，GAPDH，F(xiàn):ATGACCACAGTCCATGCCATC，R:CCTGCTTCACCACCTTCTTG；IL-6，F(xiàn):GCTCTCTGTGAGGCTGCAGTTC，R:AAGGTGTGGAATGCGTATTTATGC；IL-8，F(xiàn):GACCCCAAGGAAAAGTGGGT，R:TGACCAGCACAGGAATGAGG；TNF-α，F(xiàn):TTCCAGCTGGCCCCTTGAGC，R:GAGGGCATTGGCATACCCAC；IL-10，F(xiàn):GACGTAATGCCGAAGGCAGA，R:TGGAGCTTGCTAAAGGCACT，引物方向均為3′至5′ ，上海生物工程技術(shù)股份服務(wù)公司合成.以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法分析每個基因的相對表達量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0一般線性模型通過單方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析，均用平均值±標準差表示，并使用Duncan檢驗進行多重比較.P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié) 果

2.1 LPS對IPEC-J2細胞活力的影響

由圖1可知，不同濃度的LPS作用不同時間對IPEC-J2細胞活力顯示不同的抑制作用，當LPS作用6 h時，LPS對IPEC-J2細胞活力的抑制作用不顯著(P>0.05)；當LPS作用12 h時，隨著LPS濃度的增加，IPEC-J2細胞活力逐漸降低，且在質(zhì)量濃度為10.0 mg/L時顯著降低了細胞活力(P<0.05).而當LPS作用24 h時，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時顯著降低了細胞活力(P<0.05)，但比10.0 mg/L LPS作用12 h的細胞活力略高.因此，考慮到對細胞的損傷程度，選擇10.0 mg/L LPS作用12 h為后期IPEC-J2細胞的損傷模型.

2.2 ASP對IPEC-J2細胞活力的影響

如圖2所示，當ASP作用4 h時，隨著ASP質(zhì)量濃度的增大，細胞活力呈現(xiàn)增加趨勢，且當ASP質(zhì)量濃度為100.0 mg/L時，細胞活力達到最大值，顯著促進了細胞增殖(P<0.05).而當ASP作用時間為1,2,8,12和24 h時，隨著ASP質(zhì)量濃度的增加，對IPEC-J2細胞增殖作用不顯著(P>0.05).因此，后續(xù)實驗選擇ASP的作用時間為4 h，作用質(zhì)量濃度為50.0,100.0和200.0 mg/L.

2.3 ASP減輕LPS致IPEC-J2細胞的損傷

如圖3所示，10.0 mg/L LPS顯著降低了細胞活力(P<0.05).而與LPS組相比，ASP與LPS共作用提高了細胞活力，且在ASP質(zhì)量濃度為100.0 mg/L時，顯著提高了細胞活力(P<0.05).因此，選擇100.0 mg/L ASP作為緩解LPS對細胞損傷的最佳質(zhì)量濃度進行后續(xù)實驗.

2.4 ASP對LPS致IPEC-J2細胞內(nèi)SOD,CAT酶活力和MDA含量的影響

由圖4可知，LPS處理組的SOD和CAT酶活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，而ASP單獨處理組對SOD,CAT活力及MDA含量無顯著差異(P>0.05)；與LPS組相比，ASP組和ASP+LPS組均顯著提高了SOD和CAT酶活力(P<0.05)，且顯著降低了MDA含量(P<0.05).

2.5 ASP對IPEC-J2細胞上清液中IL-6,IL-8和TNF-α含量的影響

如圖5所示，添加LPS顯著增加細胞上清液中IL-6,IL-8和TNF-α的含量(P<0.05)，單獨添加ASP顯著降低了TNF-α的含量(P<0.05)，但對上清液中IL-6和IL-8的含量影響不顯著(P>0.05).與單獨添加LPS組相比，ASP組和ASP+LPS組均可以顯著降低細胞上清液中IL-6,IL-8和TNF-α的含量(P<0.05).

2.6 ASP對LPS致IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響

如圖6所示，添加LPS顯著上調(diào)IL-6、IL-8和TNF-α基因的相對表達量(P<0.05)，顯著下調(diào)了IL-10基因.單獨添加ASP顯著下調(diào)IL-6基因的表達量(P<0.05)，對IL-8和TNF-α基因的表達量無顯著差異(P>0.05).與LPS組相比，ASP組和ASP+LPS組顯著下調(diào)了IL-6,IL-8和TNF-α基因(P<0.05)，顯著上調(diào)了IL-10基因(P<0.05).

3 討 論

黃芪是一味歷史悠久、最為常用的中藥之一，味甘、性溫，有補氣固表、利尿之功效.ASP是黃芪的主要生物活性成分，臨床研究表明其具有增強機體免疫功能、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗氧化等多種功效[4].研究發(fā)現(xiàn)ASP對LPS誘導的內(nèi)皮祖細胞功能損傷具有保護修復作用[5]，腹腔注射LPS會造成肉仔雞的炎癥反應(yīng)，肌肉注射ASP可以緩解其引發(fā)的炎癥損傷，進而提高飼料效率[6-7].由此可見，LPS可以誘導機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，而ASP則具有抗炎作用，然而ASP對緩解LPS誘導豬腸道氧化應(yīng)激和炎癥作用機制尚不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)隨著LPS濃度的增大及作用時間的延長對細胞活力的影響越大，且10.0 mg/L LPS刺激IPEC-J2細胞12 h能使細胞活力顯著降低，這與ZHAO等[8]的研究結(jié)果一致.而ASP在作用4 h時即可促進IPEC-J2細胞的增殖，且用100.0 mg/L ASP預(yù)孵育細胞4 h后可顯著提高細胞活力.由此推斷ASP可能在參與細胞內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的受損細胞修復中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.LPS可刺激細胞產(chǎn)生大量活性氧自由基，從而引發(fā)一系列氧化應(yīng)激和炎癥等反應(yīng)[9].本研究中，LPS誘導的IPEC-J2細胞中SOD和CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高；而細胞經(jīng)過ASP預(yù)處理后顯著提高了抗氧化酶活力以及降低了MDA含量.這表明LPS誘導細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，且經(jīng)ASP預(yù)處理后顯著緩解了LPS引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng).TNF-α,IL-6和IL-1β在腸道中表達上調(diào)，與炎癥的嚴重程度相關(guān)，且TNF-α的過度表達會導致上皮屏障的損傷、上皮細胞凋亡的增加和趨化因子的分泌[10].研究發(fā)現(xiàn)，ASP通過影響THP-1源巨噬細胞IL-12,IL-10,TNF-α基因及蛋白的表達水平，從而起到調(diào)節(jié)細胞免疫功能，抑制腫瘤生長的作用.本研究發(fā)現(xiàn)LPS可誘導IPEC-J2細胞上清液中IL-6,IL-8,TNF-α的含量和其mRNA水平升高以及IL-10 mRNA水平的降低，可見，LPS可引起豬腸道上皮細胞的炎性細胞因子表達升高，引起炎癥反應(yīng)，該結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致[11].而當ASP預(yù)處理4 h后可以顯著降低促炎因子的表達和提高抗炎因子的表達.此外，LI等[12]也發(fā)現(xiàn)ASP能有效抑制LPS誘導Caco 2細胞的炎癥反應(yīng).表明ASP能夠有效抑制LPS誘導的炎癥反應(yīng)，可通過抑制LPS刺激引起的炎癥因子釋放，達到對腸道上皮細胞炎癥損傷的保護作用.

綜上，10.0 mg/L LPS作用12 h可誘導IPEC-J2細胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而ASP處理可顯著促進細胞增殖，減少LPS對細胞的損傷，顯著升高細胞內(nèi)SOD和CAT酶活力及降低MDA含量，并下調(diào)細胞上清液中IL-6,IL-8,TNF-α的含量和三者基因的表達，上調(diào)IL-10基因的表達，從而達到抗炎作用.