烏頭內生細菌組成分析△

涂然，黃文峰a，馮正平，王娜，趙陽，崔浪軍*

1.荊門市第二人民醫院，湖北 荊門 448000；2.西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062；3.西安交通大學第二附屬醫院 藥物臨床研究機構辦公室，陜西 西安 710004

毛茛科（Ranunculaceae）烏頭屬（Aconitum）植物在我國分布廣泛，約200 種，分為牛扁亞屬（Subgen.Paraconitum）、烏頭亞屬（S.Aconitum）和露蕊烏頭亞屬（S.Gymnaconitum）3 個亞屬[1]，其中烏頭屬藥用植物主要來源于烏頭亞屬[2]。附子（烏頭側根）具有祛風除濕、溫經止痛的功效，可用于風寒溫痹、關節疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉止痛等，生物堿是其主要活性物質[3]。附子是我國大宗藥材，被歷版《中華人民共和國藥典》收錄，在陜西、四川和云南等地大量種植。而烏頭的3 個變種黃山烏頭、展毛烏頭和毛葉烏頭雖然尚未規?；N植，但由于都含有與附子相同種類的生物堿，一些地方也作為附子的替代品廣泛入藥使用[4]。

植物內生菌是指生長于植物活體組織內部，但不引起明顯負面影響的細菌或真菌[5]，普遍存在于各種植物中，受環境、宿主種屬等多種因素影響。植物內生菌在與宿主植物相互作用的過程中，可能獲得合成宿主植物活性物質的能力，或能幫助宿主合成次級代謝產物[5-6]。因此，發掘能產生活性物質的內生菌，揭示內生菌與宿主合成次生代謝物質的關系具有重要的理論和現實意義。已有的研究表明，在北烏頭、川烏和草烏中分離的黃曲霉等內生真菌能生產烏頭堿[7]。但烏頭的內生細菌是否有助于烏頭合成生物堿等有效成分尚未明確。

本研究以野生烏頭及其變種為材料，對烏頭的生物堿含量及內生細菌進行研究，探討烏頭內生細菌與烏頭生物堿含量的關系，以期為烏頭生物堿合成機制的研究提供一定參考。

1 材料

1.1 樣本

2013 年7 月，從中國烏頭主要產區陜西漢中、陜西戶縣、安徽黃山、浙江臨安、甘肅蘭州等地采集野生健康烏頭（附子）Aconitum carmichaeliiDebx.、黃山烏頭A.carmichaeliivar.hwangshanicum、展毛烏頭A.carmichaeliivar.truppelianum和毛葉烏頭A.carmichaeliivar.pubescens樣品，每個產區采集樣品1 批，共5 批樣品。所有樣品經西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/陜西師范大學生命科學學院崔浪軍副教授鑒定。

1.2 試藥

次氯酸鈉（美國Alfa Aesar公司）；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、無水乙醇、氨水、異丙醇、醋酸乙酯均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇（美國Gibco 公司）；甲醇、乙腈（色譜純、德國Merck公司）；二乙胺（美國Sigma 公司）；對照品苯甲酰新烏頭原堿（benzoylmesaconine,BMA，批號：ZF0228BE14）、苯甲酰烏頭原堿（benzoylaconitine，BAC，批號：ZF0228BB14）、苯甲酰次烏頭原堿（benzoylhypacoitine，BHA，批 號：ZF0228BC14）、新烏頭堿（mesaconitine，MA，批號：ZF0228BD14）、烏頭堿（aconitine，AC，批號：ZF0228BA14）、次烏頭堿（hypaconitine，HA，批號：ZF0228BF14）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、FastPfu 緩沖液、TransStart?FastPfu DNA 聚合酶均購自北京全式金生物技術股份有限公司；AxyPrepDNA gel extraction kit（美國Axygen公司）。

1.3 儀器

5810R 型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；L-80 XP 型超高速低溫離心機（美國Beckman Coulter 公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；HHS21-6型水浴鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；ZF-206 型凝膠成像分析系統（鄭州萬博儀器設備有限公司）；BK-600D 型超聲波清洗機（山東邁福科學儀器股份有限公司）；RE-5205 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；GeneAmp 9700 型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）核酸擴增儀（美國ABI 公司）；QuantiFluor?-ST 微型熒光定量系統（美國Promega公司）；1260 Infinity LC 型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、EZChrom Elite 處理軟件（美國Agilent 公司）；Luna ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex公司）。

2 方法

2.1 樣本的采集與處理

在每個采樣地點，選取3個子地點（20 m×20 m）采集樣本，每個子地點之間的距離至少為2 km。從每個子地點隨機采集10 株健康植株。植物樣本盡快送回實驗室，分成兩組：一組先用流動的自來水沖洗除去附著的土壤，再用蒸餾水沖洗3 遍，將烏頭分成葉、莖和根3 個部分，每部分依次用70%乙醇浸泡1 min、2%次氯酸鈉洗滌3 min、70%乙醇沖洗3 次（每次持續30 s）、無菌蒸餾水洗滌3 次、滅菌濾紙進行表面干燥后，–80 ℃保存，用于宏基因組DNA 提取；另一組用流動自來水沖洗除去附著的土壤，將葉、莖和根分開，40 ℃干燥至恒重，粉碎后過100目篩，–20 ℃儲存，用于有效成分測定。

2.2 高通量測序及數據處理

經表面消毒處理的烏頭葉、莖和根組織，通過CTAB 法提取總DNA，并于–80℃保存。細菌16S rDNA V4 區的擴增引物為：515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。PCR反應體系為20 μL，含模板DNA 10 ng、1×緩沖液10 μL、4 U DNA 聚合酶、正反向引物各2 pmol、dNTP各250 μmol，加去離子水補足至20 μL。擴增程序如下：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循環25 次；72 ℃，5 min。每個樣本平行擴增3 管，平行擴增的PCR 產物混合成1管，2%瓊脂糖凝膠電泳回收純化。純化回收的PCR產物用熒光定量系統定量并歸一化處理。將上述擴增產物等摩爾混合，并根據標準規程在Illumina MiSeq測序平臺（Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd.）上進行測序（paired-end sequenced，2×250 bp）?；?6S 細菌核糖體數據庫Silva（http://www.arb-silva.de），使用軟件Trimmomatic 0.40、FLASH 1.2.11、Usearch 7.1、Mothur 1.30.1 和UniFrac 1.0 對數據去雜和分析，繪圖由R語言工具（R-forge Vegan 2.0 package）完成。

2.3 烏頭堿含量測定

2.3.1 供試品制備 精確稱取樣品粉末2 g，用25%的氨水3 mL 浸泡30 min，然后加入混合溶劑（異丙醇，醋酸乙酯-1∶1）50 mL，加塞并稱定質量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz，水溫低于25 ℃）萃取30 min。冷卻并再次稱質量，混合溶劑補足減少的質量，搖勻并用濾紙濾過。準確量取濾液25 mL，40 ℃以下減壓濃縮干燥，殘余物溶于2 mL 甲醇，過0.22 μm濾膜，濾液用于生物堿含量測定。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA 對照品0.51、0.20、0.91、1.09、0.26、1.06 mg 置同一1 mL 量瓶內，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為0.51、0.20、0.91、1.09、0.26、1.06 mg·mL–1的生物堿對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 參照劉敏等[8]HPLC 測定烏頭各組織提取物中3個雙酯型和3個單酯型烏頭堿成分的含量。流動相為乙腈（A）-0.1%二乙胺水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，28%A；8～12 min，28%～33%A；12～45 min，33%～50%A；45～55 min，50%A）；柱溫為25 ℃；檢測波長為230 nm；流速為1 mL·min–1；進樣量為20 μL；進樣器溫度保持在10 ℃。

2.3.4 方法學考察 精密度試驗：將適宜濃度的生物堿對照品溶液，按上述2.3.3 項下色譜條件分別連續進樣測定5 次，記錄各自的峰面積，計算其RSD。BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA 的RSD分別為1.63%、1.27%、1.45%、1.06%、1.51%、1.68%。

重復性試驗：精密稱取漢中產烏頭根細粉約2 g共5 份，按2.3.1 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3 項下色譜條件進行分析。根據所得6 種生物堿的峰面積計算其在樣品中的量，結果BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA 質量分數的RSD 分別為1.90%、1.73%、1.56%、1.46%、1.82%、1.62%。

加樣回收率試驗：精密稱取漢中產烏頭根細粉約1 g 共18 份，每3 份用于一種生物堿的回收率測定，共6 組。每組樣品分別加入對應的對照品溶液適量，按2.3.1 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜條件進行分析。根據測得量和加入量計算其加樣回收率（RSD）分別為101.78%（1.44%）、98.09%（2.15%）、100.48%（2.20%）、99.27%（2.03%）、98.61%（1.80%）、101.46%（1.71%）。

2.4 數據處理

采用SPSS 18.0 軟件對烏頭及其變種各組織生物堿含量進行主成分分析（principal components analysis，PCA），選取第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）作圖。15 種烏頭組織樣本的內生細菌組成基于UniFrac分析算法呈現物種多樣性矩陣，由R語言中的主坐標分析（principle coordination analysis，PCoA）統計和分析函數進行數據運算，并選擇排在第一位和第二位的特征值做圖。

采用SPSS 18.0 軟件進行數據統計學分析，計量資料以（）表示，數據對比使用獨立樣本t檢驗；均以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 烏頭生物堿含量

HPLC 測量烏頭葉、莖和根中BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA 含量。整體來說，除BHA 的含量在根、莖、葉3 個部位沒有明顯的規律外，幾種烏頭葉片BAC 含量顯著高于莖部和根部，根系BMA、MA、AC 和HA 含量整體高于地上部分。烏頭及其不同變種的生物堿含量差異較大。不同烏頭及其變種在同一個部位的幾種生物堿含量相差較大，如BMA在黃山烏頭莖中質量分數高達35.60 mg·kg–1，但在毛葉烏頭莖中未被檢出。MA 在黃山烏頭莖中質量分數為275.60 mg·kg–1，而在陜西戶縣產的烏頭中未被檢出。AC 除了在黃山烏頭的莖和葉、漢中產的烏頭莖中檢測出外，在其他烏頭和變種中的莖和葉均未被檢出（表1）。即使是同為烏頭，產自戶縣和漢中的樣品，其根莖葉中的6 種的生物堿含量差異也較大。以烏頭及其變種各組織生物堿含量進行PCA，結果（圖1）顯示，烏頭各組織樣本分為3 群：黃山烏頭根和毛葉烏頭根、展毛烏頭根和戶縣產烏頭根及其他莖葉組織。葉和莖生物堿組成較為相似，而根與葉、莖在生物堿組成上表現出明顯差異。

圖1 烏頭及其變種組織樣本生物堿含量的PCA

表1 烏頭及其變種各組織生物堿質量分數（,n=3）

注：同列不同字母表示P<0.05；nd表示未檢出。

3.2 烏頭內生細菌組成

烏頭及其變種葉、莖和根的內生細菌16S rDNA V4 區進行高通量測序，得到121 362 254 bp 數據，拼接得到305 817 條序列，有效序列占比99.99%，在97%的置信區間進行操作分類單元（OTU）分類，共得到90個OTU。漢中產烏頭、黃山烏頭、展毛烏頭、毛葉烏頭和戶縣產烏頭的內生細菌的OTU數量分別為28、78、66、61、38 個，其中20 個OTU 為烏頭共有。整體來說，烏頭內生細菌主要由4 門，9 綱，16 目，36 屬組成（無法分類的除外），其中變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度較高（圖2）。PCoA 結果見圖3，展毛烏頭莖、毛葉烏頭莖、戶縣產烏頭莖、黃山烏頭莖、戶縣產烏頭葉聚集；漢中產烏頭葉、展毛烏頭葉、漢中產烏頭根和漢中產烏頭莖、黃山烏頭葉、毛葉烏頭葉聚集；戶縣產烏頭根、展毛烏頭根和黃山烏頭根、毛葉烏頭根聚集?？傮w而言，相同組織的內生細菌組成更相似，葉和莖內生細菌組成差異明顯，黃山烏頭根和毛葉烏頭根，展毛烏頭根和戶縣產烏頭根內生細菌組成更為相似。熱圖分析結果見圖4，展毛烏頭莖、漢中產烏頭莖、黃山烏頭莖總體的菌群組成更相似，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）這3 個屬的細菌豐度接近；毛葉烏頭葉、漢中產烏頭葉、黃山烏頭葉菌群組成相似，鞘氨醇單胞菌屬細菌豐度接近；展毛烏頭根、戶縣產烏頭根聚為一支，纖發菌屬（Leptothrix）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、豐佑菌屬（Opitutus）、池塘桿菌屬（Piscinibacter）、不動桿菌屬細菌豐度接近；黃山烏頭根和毛葉烏頭根距離較近，假單胞菌屬、黃桿菌屬、獨島氏菌屬（Dokdonella）、黏液桿菌屬（Mucilaginibacter）、水小桿菌屬（Aquabacterium）細菌豐度接近。

圖2 15種烏頭組織樣本內生細菌的組成

圖3 15種烏頭組織樣本內生細菌的PCoA

3.3 烏頭內生細菌與生物堿含量的相關性

結合烏頭及其變種各組織生物堿含量和內生細菌組成的相似性，以烏頭及其變種的根（除漢中產烏頭根外）共有的內生細菌OTU 豐度與烏頭根組織生物堿含量做皮爾遜（Pearson）相關性分析。結果見表2，有6種內生細菌豐度與烏頭根組織生物堿含量正相關，分別是與AC 含量正相關的黃桿菌屬、假單胞菌屬、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）及與HA 含量正相關的豐佑菌屬、池塘桿菌屬及非培養的假單胞菌目細菌（g_norank；s_uncultured_Pseudomonadales_bacterium）。

4 討論

植物內生細菌組成受到宿主植物種屬和環境因素等多方面的影響[9]。宿主植物種屬差異意味著其內環境pH、離子濃度及活性物質的差異，即內生細菌生存環境的巨大差異，對內生細菌群落組成有重大影響。Ding 等[10]關于美國俄克拉荷馬州北部草原保護區5 個植物物種中內生細菌的多樣性及群落結構的研究也表明，內生細菌群落的生物分類組成及變化，可能主要取決于植物宿主物種的性質。同時，某些內生細菌通過種子垂直傳播到下一代植物，這也是植物種屬差異造成內生細菌不同的原因之一[11]。環境因素包括土壤、海拔、地理位置等，如土壤總碳、總氮、有效磷和pH是導致細菌群落總體組成差異的主要因素[12]。對祁連山不同海拔2種豆科植物結節內生細菌的多樣性研究表明，海拔對植物內生細菌的影響力可能大于其他生態因素[13]。而地理位置的差異導致內生細菌的一些OTU 可以充當宿主植物的地理標志，在某些情況下甚至可以充當品種指紋[14]。雖然相同種或亞種的植物生長在不同的環境導致其內生細菌的群落結構不同，但依然有一些與宿主關系密切的細菌在這些不同環境的種或亞種中存在（豐度有所不同）。Mezzasalma 等[14]關于3 個葡萄品種（Cabernet Sauvignon、Syrah 和Sauvignon Blanc）分布于不同地理及氣候條件特征（意大利北部、意大利阿爾卑斯山和西班牙北部）的內生細菌研究顯示所有的葡萄樣品均具有一些共有細菌類群，而與采樣地點無關。例如，芽胞桿菌屬（Bacillus）、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和其他屬屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌門。

本研究結果顯示，黃山烏頭OTU 最多，但黃山烏頭、展毛烏頭、毛葉烏頭相差不大，內生細菌均較陜西漢中產的烏頭和陜西戶縣產的烏頭更為豐富。多樣性指數表明，黃山烏頭、展毛烏頭和毛葉烏頭內生細菌較陜西漢中產的烏頭和陜西戶縣產的烏頭組成更多樣。但烏頭及其變種內生細菌菌群組成存在相似之處。首先，內生細菌主要由變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門組成，其中變形菌門占主導。這與藥用植物白及內生細菌的組成變形菌門（83.87%）占主導相一致[15]。其次，有20個OTU為烏頭及其變種所共有，而這20個OTU中所對應的薄層菌屬（Hymenobacter）、鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬、甲基桿菌屬、池塘桿菌屬基本屬于烏頭的優勢內生細菌，這說明烏頭及其變種內生細菌菌群組成的核心部分較相似。最后，烏頭及其變種內生細菌的豐度和多樣性就不同組織而言，基本表現為根>葉>莖，相同組織的內生細菌菌群組成更相似。

雖然環境因素在一定程度上影響了烏頭不同變種內生細菌的豐度和多樣性，但遺傳特性接近的烏頭及其變種的主要內生細菌組成特征相似，而且根組織特定種屬的內生細菌豐度與該組織生物堿的含量存在相關性。烏頭根組織生物堿含量與內生細菌黃桿菌屬、假單胞菌屬、叢毛單胞菌科及豐佑菌屬、池塘桿菌屬、非培養的假單胞菌目細菌豐度成正相關。黃桿菌屬、假單胞菌屬、叢毛單胞菌科、豐佑菌屬作為植物內生菌在植物的根部很常見[16-18]。盡管在過去的研究中黃桿菌屬的菌株與宿主植物的生長促進沒有表現出直接關系，但仍有研究表明根中的黃桿菌屬豐度與宿主植物生物量呈現正相關[19]?，F有研究也表明某些黃桿菌屬菌株可以合成生長素、赤霉素和細胞分裂素等植物激素刺激宿主植物生長[20]。同時，根中黃桿菌屬的細菌豐度與宿主植物對病原體的抗性也呈現正相關[21]。假單胞菌屬和叢毛單胞菌科的細菌都具有植物促生長活性，是根組織內生菌群的主要組成[22]，Rojas-Solís 等[17]的研究中分離到植物內生細菌斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）E25 菌株不僅表現出根組織促生長效果，而且產生抗真菌揮發性有機化合物。共生細菌可以刺激或激活植物的免疫反應[23-24]，迄今為止研究的所有植物物種均產生防御化合物，尤其藥用植物的次級代謝產物一般也作為防御化合物產生[25]。內生菌在定殖的過程中直接或間接刺激宿主分泌活性物質。例如，假單胞菌屬細菌感染擬南芥葉，可以進一步推動抗菌香豆素化合物的根分泌，進而形成對宿主植物的穩定保護[26-27]。

綜上所述，烏頭及其變種的內生細菌在豐度和多樣性上存在差異，但核心菌群組成相似。且烏頭根組織特定種屬的內生細菌豐度與生物堿含量存在相關性。