基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的皖貝母生物堿類化學(xué)成分分析△

李莉婭，蒲婧哲，張亞中，*，楊青山，3，4，程杰，胡沖

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230000；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012

皖貝母，又稱安徽貝母，為百合科植物安徽貝母Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin 的干燥鱗莖，其味甘、苦，性微寒，具有清熱化痰、止咳定喘的功效，主治痰熱咳嗽、氣逆喘哮，主要分布于安徽大別山區(qū)的金寨、舒城、霍山、霍邱等地[1]，當?shù)刂嗅t(yī)歷來用以代替川貝母入藥，1990 年被批準為Ⅰ類新藥（中藥材）。

現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究表明，甾體生物堿是貝母類藥材的主要活性成分，也是特征性成分之一。目前，國內(nèi)對皖貝母的生物堿類成分研究報道較少。1986年，李清華等[2]從皖貝母中分離出4個生物堿類成分，通過光譜數(shù)據(jù)及與對照品比對，推斷為浙貝乙素（vertieinone）、貝母辛（peimisine）、異浙貝甲素（isoverticine）及皖貝甲素（wanpeinin A）。吳宗好等[3]發(fā)現(xiàn)皖貝母生物堿的含量較川貝母、浙貝母高。藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)在止咳、平喘、祛痰等藥理作用方面，皖貝母的效力都與川貝母及浙貝母相當，甚至優(yōu)于兩者[4-5]。明確皖貝母藥材中生物堿類化學(xué)成分對于進一步有效評價和控制其藥材質(zhì)量及研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-TOF-MS/MS）是近年來發(fā)展起來的較為高端的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。四級桿不用采用狹縫，具有較高靈敏度；飛行時間則可以獲得母離子和產(chǎn)物離子準確的相對分子質(zhì)量；串聯(lián)質(zhì)譜在預(yù)先沒有色譜或其他分離手段的情況下直接對粗樣品進行明確的檢測[6]。Q-TOF-MS/MS 與超高液相色譜法（UPLC）聯(lián)用時，可實現(xiàn)快速、高效鑒定天然藥物中復(fù)雜龐大的化合物體系。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 對皖貝母藥材進行檢測，通過與對照品或文獻報道比對，鑒定其中的化學(xué)成分，識別并鑒定了14 個主要色譜峰，其中8 個生物堿類成分為首次從皖貝母中鑒定出，為闡明皖貝母的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、提高其質(zhì)量控制水平提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC?型超高效液相色譜儀、Xevo G2 Q-Tof型質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配置標準電噴霧離子源（ESI）、MsFrontier 7.0軟件；Milli-Q型超純水儀（美國Millipore 公司）；ML204 型萬分之一電子天平、XP26 型百萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Elmasonic S 30H 型超聲波清洗器（德祥科技有限公司）。

1.2 試藥

皖貝母藥材8批，批號及產(chǎn)地分別為WB-1（霍山縣太陽鄉(xiāng)）、WB-2（霍山縣爛泥坳鄉(xiāng)）、WB-3（霍山縣太陽鄉(xiāng)）、WB-4（舒城縣曉天鎮(zhèn)）、WB-5（岳西縣沈橋鄉(xiāng)）、WB-6（岳西縣沈橋鄉(xiāng)）、WB-7（金寨縣張沖鄉(xiāng)）、WB-8（金寨縣張沖鄉(xiāng)），由安徽省食品藥品檢驗研究院張亞中主任中藥師鑒定為百合科植物安徽貝母Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin 的干燥鱗莖；對照品梭砂貝母酮（批號：11J-STG-28-6，純度：98%，Panphy Chemicals Corporation公司）；貝母辛（批號：111892-201402，純度：100%，中國食品藥品檢定研究院）；色譜級異丙醇和甲酸銨購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜級甲醇，質(zhì)譜級甲酸、乙腈購自美國Fisher公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

2 方法

2.1 液相色譜條件

CORTECS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；柱溫為35 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸和10 mmol·L–1甲酸銨水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15%～25%A；20～30 min，25%～50%A；30～32 min，50%～20%A）；流速為0.4 mL·min–1；進樣量為2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI 正電離模式，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流量為500 L·h–1；碰撞電壓為50～90 V；碰撞氣體為氬氣；掃描時間為0.2 s；質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1500；采集過程中采用亮氨酸腦啡肽進行實時校準。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取梭砂貝母酮、貝母辛對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為40 mg·L–1的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

取皖貝母粉末（過四號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨水4 mL，堿化30 min；加異丙醇-甲醇（1∶1）混合溶液20 mL，超聲處理（360 W，50 Hz）30 min，濾至25 mL量瓶中，用異丙醇-甲醇（1∶1）混合溶液洗滌藥渣2～3次，加異丙醇-甲醇（1∶1）至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，即得。

2.5 樣品分析

取供試品、對照品溶液，按2.1、2.2 項下條件進樣分析。查閱文獻，總結(jié)貝母屬植物中化合物信息，包括分子結(jié)構(gòu)式、相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)信息等，結(jié)合MarkerLynx XS 應(yīng)用軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，建立皖貝母生物堿類化合物的一、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。通過文獻查閱，再結(jié)合MS Frontier 7.0 軟件分析，總結(jié)皖貝母中已知生物堿的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，推測皖貝母中可能存在的化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 皖貝母生物堿類化學(xué)成分分析

結(jié)果顯示，皖貝母生物堿類化學(xué)成分在正離子模式下大多具有較好的響應(yīng)，因此采用正離子模式進行質(zhì)譜分析。在正離子模式下，準分子離子峰一般為[M+H]+。正離子模式下皖貝母UPLC-Q-TOFMS/MS 的總離子流色譜見圖1。以MarkerLynx XS應(yīng)用軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)合相關(guān)文獻數(shù)據(jù)及部分對照品的質(zhì)譜信息，共鑒定和推測了皖貝母中化學(xué)成分14個，其中生物堿類成分12個、非生物堿類成分2 個。化合物6 和10 經(jīng)與對照品比對確認，分別為貝母辛和梭砂貝母酮，結(jié)果見表1[7-11]。

圖1 皖貝母正離子模式下UPLC-Q-TOF-MS/MS的總離子流色譜圖

化合物3～14（圖2）為皖貝母中生物堿類化學(xué)成分，按其結(jié)構(gòu)類型可將其分為甾體生物堿（化合物3～6、8～10、12～14）和異甾體生物堿（化合物7、11）2 類，其中化合物4、5、8～10、12～14 又屬于甾體生物堿的瑟文型（Cevanine group），化合物3、6為甾體生物堿的介藜蘆型（Jervine group），化合物7、11 為異甾體生物堿的裂環(huán)茄堿型（secosolanidine group）；皖貝母中生物堿類化合物多以甾體類生物堿為主且多為瑟文型。化合物3、6、9、11、13 在該色譜條件下峰面積較大。其中化合物3、5、7～11、13為首次從皖貝母中鑒定出。

3.2 3個代表性皖貝母生物堿化合物的質(zhì)譜分析

瑟文型生物堿碎裂規(guī)律以化合物12 為例進行說明。化合物12的分子組成為C27H45NO3，正離子模式下經(jīng)一級質(zhì)譜掃描得到準分子離子峰m/z432.342 2[M+H]+，在二級質(zhì)譜中[M+H]+分子離子有多條碎裂路徑：路徑A 通過氫重排和堿性碳骨架斷裂形成豐度較高的m/z112.102 7 碎片離子；路徑B 經(jīng)脫CH3、D 環(huán)斷裂、脫H2O 后形成m/z176.113 8 碎片離子；路徑C 經(jīng)脫CH3和H2O 形成特征碎片m/z398.299 3；路徑D 經(jīng)脫H2O 獲得m/z414.331 4 的碎片信息。在化合物12 中能觀察到m/z176.113 8，而化合物5、8、9、13、14 中均未觀察到m/z176.113 8 碎片離子，由此可以得出m/z176.113 8 碎片離子的形成與C-20 位的羥基有關(guān)。結(jié)合相關(guān)文獻報道，推測化合物12為異浙貝母堿。質(zhì)譜碎裂途徑見圖3。

圖3 異浙貝母堿質(zhì)譜碎裂途徑

介藜蘆型生物堿碎裂規(guī)律以化合物6 為例進行說明。化合物6 的分子組成為C27H41NO3，在一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子為m/z428.315 9[M+H]+，二級碎片離子中相對豐度較高的主要有m/z410.300 5、337.212 0、114.082 4、81.063 1 等。m/z410.300 5為準分子離子[M+H]+脫去1 分子H2O 而形成；[M+H]+可通過2 條碎裂途徑得到m/z337.212 0，2 條碎裂路徑均為[M+H]+連續(xù)丟失1 分子H2O 和C4H11N 基團，不同之處在于脫去H2O 和C4H11N 基團的順序；m/z114.082 4的產(chǎn)生是C-17和C-23位的C 之間存在O橋，導(dǎo)致E環(huán)斷裂損失C21H30O2形成；m/z81.063 1碎片離子的產(chǎn)生也有2條裂解路徑，可由F環(huán)開裂丟失NH4基團后，E環(huán)在開裂丟失C21H30O3基團后形成；也可由E、F環(huán)同時開裂先后脫去C21H30O3和NH4基團而形成。再結(jié)合其他二級碎片離子及對照品，可推測化合物6為貝母辛。質(zhì)譜碎裂途徑見圖4。

圖4 貝母辛質(zhì)譜碎裂途徑

化合物7 為首次從皖貝母中鑒定出，屬于裂環(huán)茄堿型生物堿。化合物7 的分子組成為C34H57NO7，其準分子離子m/z592.422 1[M+H]+，[M+H]+脫去糖苷或葡萄糖中性丟失后形成的特征碎片分別是m/z430.364 8、412.354 6；m/z576.389 6碎片則是由于C=O 斷裂，脫去O 所形成。化合物7 為葡萄糖苷類生物堿具有一定的穩(wěn)定性，相對于其他生物堿類結(jié)構(gòu)二級碎片離子較少。查閱相關(guān)文獻，化合物7 一級、二級質(zhì)譜碎片離子與本實驗中所得到的碎片離子基本一致，推測化合物7 為puqietinonoside。質(zhì)譜碎裂途徑見圖5。

圖5 puqietinonoside質(zhì)譜碎裂途徑

4 討論

皖貝母中的甾體生物堿類大多結(jié)構(gòu)相似，為使這些結(jié)構(gòu)相似的成分能夠得到良好的檢測和分離，本實驗考查了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-10 mmol·L–1甲酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸和10 mmol·L–1甲酸銨水溶液等不同流動相和洗脫梯度，同時考查了ACQUITYUPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CORTECS?C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、CORTECSC18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）等不同色譜柱，實驗結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸和10 mmol·L–1甲酸銨水溶液、CORTECS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱和2.1項下的色譜條件，可以將皖貝母中生物堿類成分很好地分離。同時本實驗對質(zhì)譜條件也進行了一定的優(yōu)化，分別進行了在正、負離子2 種模式的測定，結(jié)果表明，皖貝母中生物堿類化合物在正離子模式下響應(yīng)較好，對錐孔電壓和碰撞能量也進行了一定優(yōu)化，因為其對獲得二級碎片信息的影響很大。考慮到靈敏度和獲得最多的碎片信息，錐孔電壓設(shè)置為30 V，碰撞電壓設(shè)置為50～90 V。在皖貝母醇提物的基峰色譜圖中發(fā)現(xiàn)，有一些響應(yīng)較好的色譜峰未能鑒定出，提示皖貝母還有一些未知成分，有待進一步研究。

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS對皖貝母生物堿類化學(xué)成分進行研究。通過高分辨質(zhì)譜中精確分子質(zhì)量信息歸屬出元素組成，進一步對二級質(zhì)譜裂解碎片進行分析，結(jié)合對照品及相關(guān)文獻共鑒定出12 個生物堿類化學(xué)成分，其中8 個生物堿類化學(xué)成分為首次從皖貝母藥材中鑒別出。皖貝母中生物堿類化合物多以甾體類瑟文型生物堿為主，且其種類及含量分布均與貝母屬其他貝母具有一定差異[3,8]，也為皖貝母從貝母屬形態(tài)分類學(xué)上作為獨立的一個種提供了理論支撐。本研究結(jié)果為皖貝母生物堿類化學(xué)成分和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。