巴戟天中有效成分在Caco-2細胞模型中的吸收轉運△

張超，華悅，李喆，史輯

遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

巴戟天是茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow.的干燥根，味甘、辛，性微溫，歸腎、肝經，是我國著名的“四大南藥”之一。其主要作用是補腎陽、強筋骨、祛風濕，常用于陽痿遺精、宮冷不孕、少腹冷痛、筋骨萎軟等證[1]。《中華人民共和國藥典》2020 年版巴戟天含量測定項選用耐斯糖為定量指標成分[1]。巴戟天還含有以水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸為代表的環烯醚萜類成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗骨質疏松等多方面的藥理作用[2-6]。

中藥大多經口服吸收，小腸為口服給藥的主要吸收部位，吸收效果易受到藥物濃度、跨膜轉運方式、轉運蛋白等多種因素影響。由于人結腸癌細胞Caco-2 與人體小腸上皮細胞有相似的形態、細胞極性及連接方式，且擁有小腸上皮細胞中的堿性磷酸酶、P-糖蛋白（P-gp）、糖類、谷氨酰轉肽酶、維生素等代謝酶及轉運體，因此Caco-2 細胞單層模型被廣泛應用于藥物在腸道中的吸收、轉運、代謝的體外研究[7-10]。因此，本實驗采用Caco-2 細胞單層模型對巴戟天中水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖3 個特征性成分的腸吸收特性進行研究，明確其吸收轉運機制，以期為巴戟天有效成分的進一步開發提供參考。

1 材料

1.1 細胞

Caco-2細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試藥

DMEM 高糖培養基、無酚紅DMEM 高糖培養基、非必需氨基酸、胰蛋白酶、Hank′s 平衡鹽溶液（HBSS）均購自美國Gibco 公司；胎牛血清（FBS，美國PAN 公司）；青-鏈霉素雙抗（美國Hyclone 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、苯酚紅均購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 細胞活力檢測試劑盒、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；水晶蘭苷（批號：O0605AS，純度≥98.0%）、去乙酰車葉草苷酸（批號：J0329AS，純度≥98.0%）、鹽酸普萘洛爾（批號：318-98-9，純度>98%）均購自大連美侖生物技術有限公司；耐斯糖（批號：292-64121，純度≥99.0%，日本Wako 公司）；鹽酸維拉帕米（批號：S420204，純度>99%，美國Selleck Chemicals公司）；甲醇、乙腈等試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 儀器

H-Class/Xevo TQD 型三重四級桿液相色譜-質譜聯用儀（配有Masslynx 4.1色譜工作站）、ACQUITY UPLC 型超高效液相色譜儀、Ulyimate UHPLC AQC18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）均購于美國Waters 公司；AE240 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；Multiskan MK3 型酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；YXQ-LS-75S11 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊科學儀器有限公司）；DCMC510 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MCO-15AC 型CO2培養箱（日本三洋公司）；DW-86W100 型臥式超低溫保存箱（青島海爾醫療設備股份有限公司）；Millecell-ERS 型跨膜細胞電阻儀（美國Millipore 公司）；SHA-C 型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。

2 方法

2.1 Caco-2細胞單層模型制備

Caco-2 細胞接種于25 cm2細胞培養瓶中，采用DMEM 完全培養基（DMEM 高糖培養基41.5 mL 加入青-鏈霉素雙抗0.5 mL、非必需氨基酸0.5 mL、FBS 7.5 mL），于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。取第6～10代Caco-2細胞制成懸液，控制細胞密度為5×103個/mL，接種于24 孔Transwell 中，于腸腔（AP）側加入細胞懸液0.5 mL，于基底（BL）側加入完全培養液1.5 mL，在CO2培養箱中培養，前10 d 隔天換液，10 d 后每天換液，培養至21 d待用。

2.2 Caco-2細胞單層模型驗證

2.2.1 細胞形態學驗證 將細胞以2.1 項下相同密度接種于24 孔板中，培養21 d，于光學顯微鏡下拍照，觀察細胞形態[11]。

2.2.2 跨膜電阻（TEER）考察 細胞接種于Transwell小室中后，于第0、3、6、9、12、15、18、21 天分別測定TEER，待TEER>300 Ω·cm–2時，說明此單層細胞模型已致密、完整[12-13]。

2.2.3 酚紅透過率考察 酚紅是一種水溶性小分子物質，不易被Caco-2 細胞代謝及過膜轉運，因此選取酚紅作為泄露標志物進行考察。于接種后第3、6、9、12、15、18、21 天分別測定細胞中酚紅透過率。棄去細胞原有培養基，加入預熱至37 ℃的無酚紅完全培養基，放置于CO2培養箱中平衡30 min，棄去培 養基，于AP 側加入含酚 紅5 μg·mL–1的HBSS 0.5 mL，BL 側加入HBSS 1.5 mL，培養3 h。3 h后于BL側取培養基0.3 mL，在波長為560 nm 處測定吸光度（A），按照公式（1）計算BL 側酚紅透過量，并按照公式（2）計算表觀滲透系數（Papp）[14]。

（1）式中Q為透過藥物的總質量（μg）；VBL為BL 側培養基總體積（1.5 mL）；ABL為BL 側培養基吸光度；A空白組為空白HBSS 的吸光度；A0為酚紅初始濃度吸光度；C0為藥物初始質量濃度（μg·mL–1）。

（2）式中dQ/dt為dt時間段中透過的藥物質量（μg·s–1）；S為單層細胞表面積（cm2），本實驗中為0.3 cm2。

2.2.4 AKP 活性考察 AKP 是小腸進行消化活動時的必需酶，其主要集中于Transwell AP 側，且其含量隨細胞的分化而增加。分別取Transwell 中培養了7、14、21 d的細胞，吸棄舊培養基，用已預熱至37 ℃的HBSS 沖洗2～3 次，在AP 側加入HBSS 0.5 mL，BL側加入HBSS 1.5 mL，置于培養箱中孵育20 min，取AP 側和BL 側培養基，離心（70×g，5 min），取上清液用試劑盒測定AKP 活性，操作參照說明書。

2.3 化合物給藥質量濃度篩選

精密稱取水晶蘭苷5.062 mg、去乙酰車葉草苷酸20.003 mg、耐斯糖100.225 mg，分別用HBSS溶解并進行稀釋，配制成含水晶蘭苷5.062、2.531、1.266、0.633、0.316、0.158 mg·mL–1，去乙酰車葉草苷酸20.003、10.001、5.000、2.500、1.250、0.625 mg·mL–1，耐斯糖100.225、50.113、25.056、12.528、6.264、3.132 mg·mL–1的溶液。

將消化后的Caco-2細胞以1×105個/cm2接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h。棄去上清液，各加入完全培養基90 μL 和各質量濃度的藥物10 μL，每個質量濃度設3個復孔，同時設立3個對照孔（不加藥）和3 個空白孔（無細胞）。培養24 h 后，各孔加入CCK-8溶液10 μL，培養1 h，在450 nm 下用酶標儀測定A，按照公式（3）計算細胞存活率。

2.4 化合物給藥pH篩選

經2.3項下質量濃度篩選，采用HBSS分別配制水晶蘭苷（0.127 2 mg·mL–1）、去乙酰車葉草苷酸（0.064 8 mg·mL–1）、耐斯糖（1.250 2 mg·mL–1）溶液，均采用HCl 和NaOH 調節pH 為5.8、6.8、7.4，按2.3項下方法測定A，計算細胞存活率。

2.5 轉運實驗

2.5.1 化合物不同質量濃度對轉運的影響 用HBSS 稀釋各化合物達到所需質量濃度，與完全培養基1∶9 混合得樣品溶液，終質量濃度分別為水晶蘭苷0.127 2、0.063 6、0.031 8 mg·mL–1，去乙酰車葉草苷酸0.064 8、0.032 4、0.016 2 mg·mL–1，耐斯糖1.250 2、0.625 1、0.312 5 mg·mL–1；取符合轉運條件的Caco-2 細胞單層模型，用HBSS 清洗3 次，于AP 側加入HBSS 0.5 mL，BL 側加入HBSS 1.5 mL，于CO2培養箱中平衡30 min，棄去HBSS進行實驗。AP-BL 實驗時，于AP 側加入樣品溶液0.5 mL，于BL 側加入HBSS 1.5 mL。BL-AP 實驗時，向AP 側加入HBSS 0.5 mL，向BL 側加入樣品溶液1.5 mL。將小室置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，于90 min 吸取接受端樣品，AP 側取0.3 mL，BL 側取0.6 mL，備用，每個樣品設置3個復孔。

同時設立P-gp 抑制劑鹽酸維拉帕米對照組，兩側的轉運溶媒都加入鹽酸維拉帕米，使其終濃度為1×10–4mol·L–1，計算90 min后藥物的累積透過量和Papp，操作同上。

2.5.2 化合物不同作用時間對轉運的影響 用HBSS 稀釋各化合物，加入Caco-2 細胞單層模型，操作同2.5.1 項下。將小室置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，分別于30、60、90、120、150、180 min吸取接受端樣品，AP 側取0.3 mL，BL 側取0.6 mL，備用，每個樣品設置3個平行復孔。

2.6 含量測定

2.6.1 供試品溶液制備 精密吸取跨膜轉運液，于4 ℃離心（10 142×g，10 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.6.2 對照品溶液制備 用HBSS 配制含水晶蘭苷5.090 mg·mL–1、去乙酰車葉草苷酸6.475 mg·mL–1、耐斯糖3.170 mg·mL–1的對照品溶液，備用。

2.6.3 色譜與質譜條件 水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸色譜條件：Ulyimate UHPLC AQ-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，2%～15%A）；檢測波長為235 nm；流速為0.3 mL·min–1；進樣體積為2μL；柱溫為25 ℃。

耐斯糖色譜及質譜條件：ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～13 min，35%～45%A）；流速為0.3 mL·min–1；進樣體積為1μL。采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式掃描；離子掃描范圍為m/z50～1000；毛細管電離電壓為3.0 kV；源溫度為150 ℃；脫溶劑溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為1000 L·h–1；錐孔氣流速為50 L·h–1；多反應監測模式（MRM）；錐孔電壓為100 V；碰撞能量為42 eV，母離子與子離子分別為m/z665.095 8、89.025 1。

2.6.4 線性范圍考察 用HBSS 稀釋各對照品溶液，得到水晶蘭苷質量濃度為0.127、0.636、1.273、3.818、5.090 mg·mL–1，去乙酰車葉草苷酸質量濃度為0.064 8、0.324 0、0.648 0、1.295 0、3.238 0、6.475 0 mg·mL–1，耐斯糖質量濃度為0.159、0.793、1.585、2.378、3.170 mg·mL–1的系列對照品溶液，按2.6.3 項下色譜、質譜條件測定，以各成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，計算各成分的回歸方程和線性范圍。

2.6.5 專屬性考察 比較各成分及HBSS 色譜圖，確認各成分之間是否存在干擾、HBSS 有無雜質干擾、HBSS對各成分是否存在干擾。

2.6.6 精密度試驗 精密吸取各對照品溶液，按2.6.3項下色譜條件，于1 d 內分別進樣5 次，再將其于5 d 中每日進樣1 次，計算水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖峰面積的RSD。

2.6.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，照2.6.3項下方法，于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，計算水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖峰面積的RSD。

2.6.8 重復性試驗 精密吸取同一小室BL 側溶液6次，每次100 μL，按2.6.1項下方法制成供試品溶液，進樣，計算水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖含量的RSD。

2.6.9 加樣回收率試驗 精密吸取同一小室BL 側溶液6 次，每次0.1 mL，按照比例（對照品加入量-樣品中含量1∶1）加入混合對照品溶液，照2.6.1項下方法制備供試品溶液，分別測定。計算水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖的平均加樣回收率及RSD。

2.6.10 透過量測定 采用Papp作為評價指標，測定各化合物透過量。

3 結果

3.1 Caco-2細胞單層模型驗證

3.1.1 細胞形態學考察 于倒置顯微鏡下觀察培養了21 d 的Caco-2 細胞，發現細胞整體呈鋪路石樣形態，細胞之間緊密連接（圖1）。

圖1 培養21 d后Transwell中Caco-2細胞形態

3.1.2 TEER 考察 在培養21 d 內，Caco-2 細胞TEER 變化趨勢為先上升然后小幅度下降，最后保持平穩，第21 天，Caco-2 細胞TEER 為（418.8±10.1）Ω·cm–2，說明單層細胞模型制備成功（圖2）。

圖2 Transwell中Caco-2細胞TEER變化（,n=3）

3.1.3 酚紅透過率考察 結果見表1，發現第18 天開始，Caco-2細胞中酚紅的Papp低于轉運實驗規定的1×10–6cm·s–1，說明單細胞層完整性符合轉運實驗要求[15]。

表1 Caco-2細胞單層模型的酚紅Papp（n=3）

3.1.4 堿性磷酸酶活性考察 培養7、14、21 d Transwell 兩側培養基中AKP 活性見表2。第14、21 天，AP 側AKP 活性分別是BL 側的3.4、6.4 倍，表明在AP 側已發生了明顯、穩定的極化現象，Caco-2細胞單層模型制備成功[16]。

表2 Caco-2細胞單層模型AKP活性（,n=3）

表2 Caco-2細胞單層模型AKP活性（,n=3）

注：與BL側比較，**P<0.01；1金氏單位=7.14 U·L–1。

3.2 不同質量濃度化合物對Caco-2細胞活性的影響

結果表明，水晶蘭苷質量濃度≤0.126 6 mg·mL–1、去乙酰車葉草苷酸質量濃度≤0.062 5 mg·mL–1時，Caco-2 細胞存活率>98%，可在此質量濃度范圍內進行實驗；在各質量濃度耐斯糖作用下，Caco-2 細胞存活率均大于98%，且質量濃度越小細胞存活率越高（表3），故選取0.312 5 mg·mL–1作為其最小質量濃度進行實驗。

表3 不同質量濃度化合物作用下Caco-2細胞存活率（n=3）

3.3 不同pH化合物對Caco-2細胞活性的影響

在pH為7.4時，3種成分對Caco-2 細胞活性影響均最小（表4），因此選擇pH 7.4進行后續實驗。

表4 不同pH化合物作用下Caco-2細胞存活率（n=3）

3.4 方法學考察結果

巴戟天中3 個化合物的回歸方程及線性范圍見表5。比較HBSS，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖對照品溶液和經細胞膜透過后各化合物色譜圖。結果表明，HBSS 無雜質干擾，HBSS 對各成分無干擾（圖3～4）。

圖3 HBSS、水晶蘭苷與去乙酰車葉草苷酸對照品溶液及經細胞單層模型透過后各化合物HPLC圖

表5 巴戟天中3個化合物的回歸方程及線性范圍

精密度試驗結果表明，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖日內精密度的RSD 分別為1.71%、1.88%、1.97%，日間精密度RSD 分別為1.74%、1.70%、1.91%，表明方法精密度良好。重復性試驗結果表明，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖含量RSD 的分別為1.12%、1.60%、1.05%，表明該方法重復性較好。穩定性結果表明，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖峰面積RSD分別為1.80%、1.90%、1.78%，說明儀器在此實驗條件下12 h內穩定。加樣回收率試驗結果表明，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖的平均加樣回收率分別為98.09%、101.14%、100.49%，RSD 分別為0.97%、1.54%、1.59%，見表6。

表6 巴戟天中3個化合物的加樣回收率試驗結果

圖4 HBSS、耐斯糖對照品溶液及經細胞單層模型透過后耐斯糖HPLC圖

3.5 跨膜轉運實驗

3.5.1 化合物不同質量濃度對轉運的影響 90 min內，3 個質量濃度水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖的Papp均大于1×10–5cm·s–1，說明三者體內吸收均良好。相比于高滲透性對照藥鹽酸普萘洛爾[Papp為（0.423 0±0.056 9）×10–4cm·s–1）]，三者均為高滲透性化合物。在90 min 時間內，PappAP-BL與PappBL-AP 的比值均接近1，說明這3 個成分在轉運此過程中無方向性。加入P-gp 抑制劑維拉帕米后Papp變化不大，說明水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖的小腸吸收不需要載體，其吸收機制可能是被動吸收（表7）。

表7 水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖在Caco-2細胞單層模型中的Papp（,n=6）

表7 水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖在Caco-2細胞單層模型中的Papp（,n=6）

注：PappV為加入維拉帕米后的Papp。

3.5.2 化合物作用不同時間對轉運的影響 如圖5所示，隨著時間的延長，3 個化合物雙側Papp均呈增加趨勢，且低質量濃度組雙側Papp明顯大于中、高質量濃度組，說明三者的小腸吸收可能存在自身質量濃度抑制現象。

圖5 不同質量濃度水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖的Papp隨時間變化情況（,n=6）

4 討論

本實驗中篩選化合物質量濃度時發現，即使最大質量濃度的耐斯糖也未對Caco-2 細胞活性造成影響，這可能是由于此細胞營養液中需要大量糖分供給，耐斯糖作為營養物質不會對細胞活性產生影響。在水晶蘭苷的液相色譜圖中無其他物質的明顯色譜峰出現，而在去乙酰車葉草苷酸的液相色譜圖中可見少量水晶蘭苷的色譜峰，可見在跨膜轉運過程中可能有少量的去乙酰車葉草苷酸轉化成水晶蘭苷，推測去乙酰車葉草苷酸可能存在首過代謝。

在Caco-2 細胞單層模型中，通常認為吸收完全的藥物Papp高（>1×10–6cm·s–1），吸收不完全的藥物Papp低（0.1×10–6～1.0×10–6cm·s–1）[17]。本實驗中水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖3 個成分的Papp均大于10–5cm·s–1，說明這3 個成分在小腸內的吸收均良好。可以通過計算藥物在小室雙側Papp的比值判斷藥物的吸收機制[18-19]，在加入維拉帕米后，若得到幾乎不變的Papp，則說明藥物為被動吸收機制。本研究考察了水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖質量濃度、時間、pH與P-gp抑制劑維拉帕米在水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖吸收轉運況的影響，在90 min內，不同質量濃度的化合物雙側Papp比值均接近1，且加入維拉帕米后不同質量濃度藥液Papp差異無統計學意義，進一步證實這3 個成分在小腸內主要以被動轉運為主。