五味子藥材提取工藝優化及8個木脂素類成分含量測定△

朱琳，侯麗華，劉亮亮，陳素娥

山西衛生健康職業學院，山西 晉中 030619

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，主產于我國東北部，又稱“北五味子”，是臨床上常用的益氣生津、補腎寧心的傳統中藥[1]。五味子提取物的主要化學成分有木脂素、多糖、揮發油、有機酸等[2-5]，其中，木脂素是最主要的藥理活性成分，具有保護肝臟、延緩心肌和血管重構、改善記憶及認知障礙、抗炎及免疫調節等作用[6-10]。目前，從五味子中分離得到木脂素類成分約50 個[2]，《中華人民共和國藥典》2020 年版規定，以五味子醇甲含量作為五味子藥材及飲片質量控制的指標。中藥成分復雜，其質量還易受采收時間、加工方法、貯藏條件等因素的影響[11-12]，因此，1 個指標不能全面反映五味子的質量。藥材質量的差異導致相關制劑的質量與安全也難以保障，加強五味子質量控制極其重要。

響應曲面法是數學方法與統計方法結合的產物，是對感興趣的響應受多個變量影響的問題進行建模和分析，以達到優化該響應的目的[13-14]。響應曲面法通過圖形技術將因素與響應的函數關系顯示出來，以供研究者直觀地選擇試驗設計中的最優化條件。響應曲面法比正交設計更簡單，比均勻設計更全面，可有效減少實驗次數，縮短周期，已廣泛應用于醫藥、化工等領域[15-16]。目前，尚未見有關五味子木脂素類成分提取工藝的研究報道。因此，本研究以五味子中8個木脂素類成分總含量為響應值，采用Box-Behnken試驗設計模型及響應面法分析五味子木脂素類成分提取工藝的影響因素及相互關系，并建立8 個木脂素類成分的高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法，分析評價不同產地五味子藥材中木脂素類成分的含量差異，以期為五味子中木脂素類成分的提取工藝及五味子藥材與其相關制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LK/CSJ-30 型超聲波清洗機（老肯醫療科技有限公司）；XSE204型萬分之一天平、XPE105型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SC-3610型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器公司）。

1.2 試藥

對照品五味子醇甲、五味子甲素（天津一方科技有限公司，批號分別為1506570、1506571）純度均≥98%；五味子醇乙、當歸酰戈米辛、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子乙素、五味子丙素（批號分別為CHB190212、CHB180223、CHB180223、CHB180223、CHB180126、CHB180129）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均≥98%；純凈水（杭州娃哈哈集團）；甲醇、磷酸（天津大茂化學試劑廠，色譜純）。

15 批五味子藥材均收集于吉林省延邊州和白山市，經山西衛生健康職業學院生藥教研室楊翠玲副教授鑒定為五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。產地信息見表1。

表1 15批五味子藥材產地

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZB-Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.5%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，46%～52%B；30～33 min，52%～65%B；33～45 min，65%～68%B；45～50 min，68%～90%B；50～53 min，90%～100%B）；流速為1 mL·min–1；檢測波長為220 nm；進樣量為10μL；柱溫為35 ℃。

2.2 對照品溶液制備

分別取對照品五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為1.051、0.992、0.928、1.033、0.950、0.993、1.002、1.045 mg·mL–1的對照品儲備液，再精密吸取對照品儲備液適量，加甲醇制成質量濃度分別為420.40、99.20、74.24、30.99、76.00、79.44、160.32、20.90 μg·mL–1的混合對照品溶液，4 ℃下保存待用。

2.3 Box-Behnken響應面法優化提取工藝

2.3.1 試驗設計及結果 查閱文獻和單因素試驗發現，對五味子藥材超聲提取影響比較顯著的3 個因素分別為超聲時間（A）、甲醇體積分數（B）和料液比（C）。

利用Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，以8個木脂素類成分總含量為響應變量，A、B、C 為3個獨立變量，設計三因素三水平中心組合試驗，因素水平見表2，Box-Behnken設計及結果見表3。

表2 五味子提取工藝響應面試驗因素與水平

表3 Box-Benhnken中心組合試驗優化五味子提取工藝設計及結果

2.3.2 回歸模型建立及顯著性檢驗 通過Design Expert 11 軟件將獨立變量A、B、C 對五味子8 個木脂素類成分總含量（Y）進行二次響應面回歸分析和方差分析，建立多元二次響應面回歸模型方程：Y=2 403.40+1.13A+270.25B+385.63C–18.50AB–20.75AC–261.00BC–79.08A2+4.17B2–425.57C2。模型的方差分析結果見表4。

表4 優化五味子提取工藝Box-Behnken響應面二次回歸方程方差分析結果

由表4 方差分析結果可知，模型F值為6.34，P值為0.011 8<0.05，表明該模型顯著。模型相關系數（r）=0.890 8，校正決定系數（R2Adj）=0.750 3，表明此模型可以解釋75.03%的響應值變化，誤差較小。各項方差分析中，B對8個木脂素類成分總含量的影響差異有統計學意義（P<0.05），C2、C對8個木脂素類成分總含量的影響差異有統計學意義（P<0.01），表明這些因素的改變會對結果響應產生顯著影響。通過比較A、B、C三因素的F值可知，各因素對8個木脂素類成分總含量的影響程度為C>B>A。綜上所述，該模型結果可靠性強、擬合度較好，可用來對超聲輔助提取五味子中8個木脂素類成分工藝研究進行初步分析和預測。

2.3.3 響應面圖與等高線圖分析 為更直觀地分析提取條件中各變量之間的交互作用，利用Design Expert 11軟件選取2個因素繪制響應曲面圖和等高線圖（圖1）。由圖1可知，隨著甲醇體積分數的增加，8個木脂素類成分總含量逐漸增加，隨著料液比和超聲時間的增加，總含量呈現先增后減的趨勢，料液比的響應曲面最為陡峭，對響應值的影響最為顯著，超聲時間的影響最小，甲醇體積分數與料液比的交互作用、超聲時間和料液比的交互作用對總含量影響差異有統計學意義，超聲時間和甲醇體積分數的交互作用影響差異無統計學意義。

2.3.4 最優提取工藝確定與驗證 利用Design Expert 11 軟件進行計算，得到五味子藥材中8 個木脂素類成分最佳提取工藝的理論預測條件：超聲時間為28.72 min，甲醇體積分數為100%，料液比為1.00∶52.99，預測得到的8 個木脂素類成分總質量分數為2 670.15～2 688.15μg·g–1。結合實際操作的可行性，將提取工藝條件修正為超聲時間30 min，甲醇體積分數為100%，料液比1∶50，按照確定的最佳提取工藝平行制備3 份，得到實際8 個木脂素類成分總質量分數分別為2 687.35、2 680.58、2 678.56μg·g–1，表明多元回歸方程具有良好的預測性。

2.4 樣品溶液制備

將樣品粉碎，取粉末約1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min后取出，放至室溫，用甲醇補足減失質量，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液，即得。

2.5 五味子中8個木脂素類成分的含量測定

2.5.1 專屬性考察 精密吸取空白溶劑（甲醇）、混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，按2.1 項下色譜條件進樣，色譜圖見圖2。供試品溶液色譜圖中的色譜峰與對照品溶液色譜圖中的色譜峰一一對應，空白溶劑色譜圖中沒有相應保留時間的色譜峰，表明該方法的專屬性良好。

2.5.2 線性關系考察 精密吸取2.2 項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列不同質量濃度的混合對照品溶液。按2.1 項下色譜條件進樣分析，以質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。見表5。

表5 五味子8個木脂素類成分的線性關系

2.5.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，進行日內精密度考察；連續進樣3 d，進行日間精密度考察。檢測各成分所對應的色譜峰峰面積，計算RSD。結果顯示，日內精密度試驗五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的色譜峰峰面積RSD分別為0.15%、0.14%、0.18%、0.18%、0.15%、0.14%、0.17%、0.17%；日間精密度試驗的RSD 分別為1.02%、1.00%、1.05%、0.83%、0.81%、0.87%、0.46%、0.57%，均小于2%，表明方法精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批的五味子藥材（S11），按2.4 項下方法平行制備6 份，按2.1 項下色譜條件下進樣，計算8 個木脂素類成分含量的RSD，結果分別為1.21%、1.11%、1.17%、1.26%、1.21%、1.16%、1.55%、1.07%，表明本方法重復性較好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批五味子藥材（S11）9 份，每份約0.5 g，分別加入50%、100%、150%的混合對照品溶液適量，按2.4項下方法制備，每個濃度平行3 份，計算平均回收率，結果見表6。

表6 五味子8個木脂素類成分加樣回收率試驗

2.5.6 穩定性試驗 取同一批的五味子藥材（S11），按2.4項下方法制備，分別于制備后0、2、4、8、12、24、48 h后按2.1項下色譜條件進樣分析，計算五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的峰面積RSD，結果分別為1.21%、1.08%、1.12%、1.18%、1.12%、0.88%、1.00%、2.14%，表明供試品在48 h 內穩定性良好。

2.5.7 含量測定 按2.4 項下方法制備樣品溶液，按2.1 項下的色譜條件進樣分析，計算各指標成分的含量，結果見表7。

表7 15批五味子藥材中8個木脂素類成分的質量分數

3 討論

實驗中采用全波長掃描（210～380 nm）測定對照品溶液，結果表明，檢測波長為220 nm 時各對照品響應均很高，因此選擇220 nm 作為最終檢測波長；有機相考察了甲醇和乙腈，對比發現，用乙腈-水體系時基線比較平穩，但色譜峰峰形不是特別好，特別是當歸酰戈米辛H 拖尾比較嚴重，為了改善峰形，減少拖尾現象，在水相中加入體積分數分別為0.1%、0.2%、0.5%的磷酸，考察其對色譜參數的影響。結果發現，水相中磷酸體積分數為0.5%時色譜基線較好，指標成分的對稱因子接近1，拖尾現

象明顯改善、分離度較高、理論板數較高，因此選擇磷酸的體積分數為0.5%；對于色譜柱，首先嘗試了通用型色譜柱Agilent ZORBAX?Eclipse plus，該色譜柱幾乎適用于所有類型的樣品，包括酸性、堿性和中性化合物。結果顯示，大部分化合物均達到較好的分離效果，但是極性小的化合物分離不開。之后又考察了Waters XSelect?HSS T3 和Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱，發現在XSelect?HSS T3色譜柱條件下化合物前延比較嚴重，改善流動相后也沒有較好的改善，而Agilent ZORBAX EXTEND-C18相比而言，峰形和分離度都較好，出峰時間也比較適宜。

本研究采用響應面法優化超聲輔助提取五味子藥材中8個木脂素類成分，通過Box-Behnken響應面試驗，得到超聲時間、甲醇體積分數、料液比對五味子中8 個木脂素類成分總含量的回歸模型，進而分析得出最佳提取工藝為超聲時間30 min，甲醇體積分數為100%，料液比1∶50。三者的影響主次關系為料液比>甲醇體積分數>超聲時間。通過驗證實驗證明實測值與預測值的相對誤差在合理范圍內，說明該優化工藝較為科學、可靠、準確，可用于五味子藥材中木脂素類成分的提取。在此基礎上，本研究建立了同時測定五味子藥材中8 個木脂素類成分含量的HPLC，此方法專屬性強、重復性好、簡單高效，可為五味子藥材的質量控制提供參考。15批不同產地的五味子藥材中8 個木脂素類成分的含量的RSD 為8.09%～19.29%，表明各產地藥材質量有一定差異，可能與當地的地質、水源及氣候條件有關，更明確的原因需要做進一步的分析研究。