二硫化碳對不同磷化氫抗性赤擬谷盜毒力、呼吸和解毒酶活性的影響

何文強， 李麗， 李柏樹， 張廣平， 張俊爭， 劉濤

1.中國農業大學 植物保護學院，北京 100193；2.中國檢驗檢疫科學研究院 裝備技術研究所，北京 100020

磷化氫(PH3)熏蒸作為防治倉儲害蟲的主要手段，已經在世界范圍內應用了近60年[1-2]．但是由于大規模、不規范地使用磷化氫，許多倉儲害蟲已經對磷化氫產生了一定的抗藥性[3-5]．目前，高磷化氫抗性的倉儲害蟲在世界各地均有報道，如澳大利亞多個地區的銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus)的磷化氫抗性倍數均達到400倍以上[6]，從美國不同地區收集的赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)中發現有磷化氫抗性倍數達127倍的種群[7]；在我國的福建、海南、山東、廣東、湖南等地區收集的赤擬谷盜、銹赤扁谷盜和谷蠹(Rhizoperthadominica)對磷化氫均有抗性，最高抗性可達1 173.6倍[8-9]．

隨著倉儲害蟲對磷化氫的抗性逐步增強，用磷化氫防治倉儲害蟲的成本也越來越高．因此，國內外的研究者急于尋找一種替代性熏蒸劑來減少對磷化氫的依賴性．Jagadeesan R等[10-11]的研究表明，在幾種主要的倉儲害蟲中，硫酰氟(SF)和磷化氫之間均不存在交互抗性．研究者們也在逐步探索甲酸乙酯(EF)[12-13]等藥劑能否充當磷化氫的替代品，或者能否減少對磷化氫的依賴．雖然對硫酰氟、甲酸乙酯等替代性熏蒸劑的開發，能夠減輕對磷化氫的依賴，但是前人的研究表明，硫酰氟在熏蒸處理過程中，需要非常高的濃度才能夠殺死害蟲的卵，相比于磷化氫熏蒸處理更加昂貴[14]，并且在硫酰氟熏蒸處理之后會留下氟化物殘留[15-16]；而甲酸乙酯的吸附性很強，在投藥之后濃度會急劇下降，并且對一些水果、蔬菜具有較高的植物毒性[17-18]．

二硫化碳(CS2)是一種非常好的熏蒸劑，曾被用于熏蒸蘋果蠹蛾，與溴甲烷相比毒性較低，價格也比溴甲烷低，且熏蒸之后在水果上的殘留量較低，安全范圍較大，不易產生藥害[19]．二硫化碳與四氯化碳混合熏蒸防治倉儲害蟲谷蠹的效果也非常好，并且在糧食中也能保持低毒低殘留的特性，熏蒸過后毒氣殘留遠低于允許殘留標準[20]．二硫化碳還用于熏蒸苗木[21]、牧草種子[22]和巢脾[23]，在防治紅苕黑斑病上也有不錯的效果[24]．但是二硫化碳的沸點為46.3 ℃，空氣中燃燒極限為1.25%～44%，閃點約20 ℃，在100 ℃左右能自燃[25]，因為其易燃易爆炸的特性，不能夠長期、大面積地使用．近年來，隨著人工制氮技術的突破，氮氣作為稀釋氣體與二硫化碳混合使用能夠克服二硫化碳易燃易爆的特點，再加上熏蒸劑的安全投藥技術提高，在實際操作中能夠對二硫化碳安全使用，因此，本試驗開展了對使用二硫化碳解決磷化氫抗性問題的探索．

赤擬谷盜是一種非常重要的倉儲害蟲，屬鞘翅目、擬步甲科，食性較為廣泛，為害嚴重，除直接為害以外，還可以分泌一些有毒物質，嚴重影響糧食質量和糧食安全[13-14]．本試驗以不同品系的赤擬谷盜成蟲為試蟲，在測定各個品系的磷化氫抗性的基礎上，研究了二硫化碳對不同磷化氫抗性品系赤擬谷盜的毒力以及解毒酶活性的影響，為深入探索二硫化碳的殺蟲機理提供基礎，并且為解決磷化氫抗性問題以及有效防治倉儲害蟲提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源

赤擬谷盜的飼養方法參照趙娜娜等[26]的方法，4種品系的赤擬谷盜初始種群分別采集于我國山東齊河(QH)、廣東深圳(SZ)、山東淄博(ZB)以及澳大利亞(AU)4個地區，采用活性酵母和全麥面粉混合(質量比為1∶9)，在溫度(25±1) ℃，相對濕度65%～75%條件下避光飼養，挑選發育健康、活動能力強的成蟲作為供試蟲源．

1.2 試劑與儀器

磷化氫(PH3)標準氣(1.02%)購自北京北氧特種氣體研究所，二硫化碳(CS2)采購于北京伊諾凱科技有限公司，羧酸酯酶(CarE)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒采購于南京建成生物工程研究所，細胞色素P450(CYP450)試劑盒采購于上海江萊生物科技有限公司．

氣相色譜儀：安捷倫6890N，美國安捷倫公司生產；紫外分光光度計：U-3310，日本日立公司生產；高速冷凍離心機：5417R，德國Eppendorf公司生產；酶標儀：Spectra Max i3，美谷分子儀器(上海)有限公司生產．

1.3 赤擬谷盜各品系對磷化氫的抗性測定

根據聯合國糧食及農業組織(FAO)推薦的熏蒸劑毒力測定方法，將150頭體型相似且活動能力強的赤擬谷盜成蟲密封于容積為6 L的熏蒸罐內，用氣密性良好的注射器注射磷化氫氣體，進行熏蒸處理．具體投藥濃度和熏蒸條件見表1．

表1 4種品系赤擬谷盜的磷化氫熏蒸濃度與條件

熏蒸結束后，在通風櫥內進行散氣，散氣后取出試蟲，在飼養條件下放置7 d．記錄試蟲的死亡數量(死亡標準為使用毛筆或者解剖針觸動背部試蟲無反應[27])，計算死亡率[28]．各處理均重復3次，且根據磷化氫抗性水平判斷指標[29]判斷4種品系的抗性水平．抗性系數1～5表示抗性水平為敏感，抗性系數5～10表示抗性水平為低抗，抗性系數10～40表示抗性水平為中抗，抗性系數40～160表示抗性水平為高抗，抗性系數160以上表示抗性水平為極高抗．

1.4 二硫化碳對赤擬谷盜毒力測定

將30頭體型相似且活動能力強的赤擬谷盜成蟲密封于6 L的熏蒸罐內，熏蒸罐底部放置小風扇，投藥過后打開風扇使二硫化碳充分揮發且循環均勻，設定二硫化碳熏蒸濃度為40，50，60，70，80，90，100，110，120 g/m3．在25 ℃，相對濕度(70±5)%條件下熏蒸處理4 h．熏蒸結束后，在通風櫥中散氣，散氣后取出試蟲，在飼養條件下放置48 h．記錄試蟲的死亡數量(死亡標準為使用毛筆或者解剖針觸動背部試蟲無反應)，計算死亡率．以上各處理均重復3次，以未熏蒸的試蟲作為對照．

1.5 赤擬谷盜體內解毒酶以及蛋白含量的測定

將不同品系的赤擬谷盜在LD50的二硫化碳濃度下熏蒸4 h，散氣2 h后，以5頭成蟲一組分裝入離心管中并立即放入液氮，在液氮里放置5 min以上，未熏蒸的試蟲作為對照組，置于-80 ℃冰箱中保存．將試蟲稱質量，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍體積4 ℃預冷的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液作為酶源．根據羧酸酯酶(CarE)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒，細胞色素P450(CYP450)試劑盒說明書分別測定試蟲的酶活[30]．

總蛋白含量測定使用考馬斯亮藍染液和牛肉清白蛋白(BSA)標準溶液，參照Bradford考馬斯亮藍G-250法[31]進行測定．

1.6 熏蒸處理對赤擬谷盜呼吸強度的影響測定

呼吸強度的測定參照張凡華等[32]的方法，將30頭試蟲放在250 mL密封玻璃瓶中，以LD50濃度的CS2熏蒸4 h，分別在熏蒸開始以及熏蒸結束時測定玻璃瓶中CO2濃度．散氣后在25 ℃、相對濕度(70±5)%、黑暗的條件下放置24 h，之后將試蟲放置到250 mL的密封玻璃瓶中，再測定玻璃瓶中0 h，1 h的CO2濃度，將熏蒸處理的試蟲作為處理組，未熏蒸處理的試蟲作為對照組．對照組的呼吸強度測定：未熏蒸的30頭試蟲在密封玻璃瓶中，測定玻璃瓶中0 h和 1 h時的CO2濃度，計算其呼吸強度；熏蒸過程中呼吸強度測定：將30頭試蟲放入密封的玻璃瓶中進行熏蒸，在熏蒸過程中測定玻璃瓶中0 h和結束時的CO2濃度，并計算呼吸強度；熏蒸后的呼吸強度測定：將熏蒸過后，且飼養條件下放置24 h的試蟲再放置到密封玻璃瓶中，測定玻璃瓶中0 h和1 h的CO2濃度，并計算呼吸強度．呼吸強度以單位mL/h/個表示．

呼吸強度=(最終CO2濃度-初始CO2濃度)/(熏蒸時間×試蟲個數)

1.7 數據分析

采用Microsoft Excel統計整理相關試驗數據，用SPSS 23.0版本Duncan氏檢驗法對相關指標進行差異顯著性分析，處理與對照之間的差異顯著性采用t測驗，用POLO Plus軟件進行毒力分析．

2 結果與分析

2.1 赤擬谷盜各品系磷化氫抗性測定

根據FAO推薦的方法[21]測定4種品系對磷化氫的抗性水平，與Jagadeesan R等[10]測定的敏感品系進行比較．結果可知，AU品系抗性最低，LD50為0.033 mg/L，抗性倍數為7.1倍；QH品系的抗性其次，LD50為0.175 mg/L，抗性倍數為38.1倍；而ZB品系的抗性較高，LD50為2.110 mg/L，抗性倍數為458.6倍；SZ品系的抗性最強，LD50為4.701 mg/L，抗性倍數為1 022.0倍．根據磷化氫抗性水平判斷指標判斷4種品系中AU為低抗品系，QH為中抗品系，ZB和SZ為極高抗品系(表2)．

表2 磷化氫熏蒸處理對4種赤擬谷盜品系的毒力

2.2 二硫化碳對赤擬谷盜各品系的毒力測定

試驗結果看出，二硫化碳熏蒸對AU，QH，ZB，SZ品系的LD50分別為89.14，96.43，85.64，84.64 g/m3．4種不同磷化氫抗性水平的赤擬谷盜在二硫化碳熏蒸之后，AU，ZB，SZ品系LD50的置信區間均有重合．因此可以看出不同抗性品系的赤擬谷盜對二硫化碳的敏感性是基本相似的，磷化氫和二硫化碳之間沒有明顯的交互抗性(表3)．

表3 二硫化碳熏蒸處理對4種赤擬谷盜品系的毒力

2.3 二硫化碳熏蒸對赤擬谷盜呼吸強度的影響

試驗結果看出，在對照組中，低抗品系AU呼吸強度最高，和其他3種抗性品系間差異有統計學意義，可以看出，在抗性品系之中，呼吸強度會降低．在使用二硫化碳熏蒸赤擬谷盜的過程之中，4種品系的呼吸強度相比較于對照組均有所降低，但各處理組間差異無統計學意義．在熏蒸之后，4種品系相比較于對照組，呼吸強度均有增高．處理組相比對照組，AU品系提高2.2倍，QH和ZB品系提高1.9倍，SZ品系提高2.1倍．4種品系處理前后呼吸強度增加倍數差異無統計學意義(F3，11=1.11，p=0.40)．說明4種品系在呼吸層面對二硫化碳的響應是一致的(圖1)．

2.4 二硫化碳處理后對赤擬谷盜體內CarE活性的影響

對比對照組中4種品系的赤擬谷盜體內CarE活性水平，結果發現，ZB品系的酶活性最高，高于AU，QH，SZ 3個品系，且差異有統計學意義；QH品系顯著高于SZ品系，而AU品系和QH，SZ品系之間差異無統計學意義；對比4種品系的磷化氫抗性水平，CarE活性和抗性水平之間無相關性．處理組中，QH品系活性最高，高于AU，SZ品系且差異有統計學意義；ZB品系明顯高于SZ品系，AU品系與SZ和ZB品系之間差異無統計學意義．在同一品系的處理和對照之間，經過LD50的二硫化碳熏蒸處理前后，所有品系的CarE活性均顯著提高．其中SZ品系CarE活性提高最多，相比于對照組提高了4.12倍；其次是AU，QH品系的酶活性，分別提高了3.3倍和3.2倍；最后是ZB品系，提高了2.12倍(圖2)．

“CK”為空白對照，“處理中”表示熏蒸過程中，“處理后”為熏蒸結束24 h之后；小寫字母不同表示不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)．圖1 二硫化碳處理對赤擬谷盜呼吸強度的影響

小寫字母不同表示不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)，大寫字母不同表示未處理的不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)“*”表示同一品系空白對照與處理間差異有統計學意義(p<0.05)．圖2 二硫化碳處理對赤擬谷盜CarE活性的影響

2.5 二硫化碳處理后對赤擬谷盜體內P450s活性的影響

試驗結果可以看出，對照組中，QH品系P450s活性最高，高于AU，ZB，SZ 3個品系且差異有統計學意義；SZ品系酶活性高于AU，ZB兩個品系，差異有統計學意義，而AU和ZB酶活性之間差異無統計學意義．處理組中，AU，QH，SZ 3個品系之間差異無統計學意義，但均顯著高于ZB品系．在同一品系的處理和對照之間，經過LD50的二硫化碳熏蒸處理前后，AU品系的P450s活性顯著增高，相比較于對照組提高到1.08倍，而QH，ZB 2個品系的赤擬谷盜相比于對照組P450s的活性均顯著降低，ZB品系相比較于對照組下降到0.93倍，QH品系相比較于對照組下降到0.81倍，SZ品系無顯著性差異(圖3)．

2.6 二硫化碳處理后對赤擬谷盜體內AChE活性的影響

試驗結果看出，對照組中SZ，AU，ZB，QH 4種品系酶活有差異，且差異均有統計學意義；處理組中，SZ品系AChE的活性最高，與AU，ZB，QH之間差異均有統計學意義，AU，ZB 2個品系之間AChE的活性差異無統計學意義，但均高于QH品系．在同一品系的處理和對照之間，經過LD50的二硫化碳熏蒸處理前后，AChE的活性相比較于對照組均有顯著提高，其中ZB品系的AChE活性提高的最多，相比較于對照組提高到1.99倍，其次是QH品系，酶活性水平提高到1.49倍，AU和SZ品系提高較少，分別提高到1.27倍和1.33倍(圖4)．

小寫字母不同表示不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)，大寫字母不同表示未處理的不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)，“*”表示同一品系空白對照與處理間差異有統計學意義(p<0.05)，ns表示無顯著性差異．圖3 二硫化碳處理對赤擬谷盜P450s活性的影響

小寫字母不同表示不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)，大寫字母不同表示未處理的不同品系間差異有統計學意義(p<0.05)，“*”表示同一品系空白對照與處理間差異有統計學意義(p<0.05)．圖4 二硫化碳處理對赤擬谷盜體AChE活性的影響

3 結論與討論

利用磷化氫防治倉儲害蟲已有超過60年的歷史，隨著倉儲害蟲抗藥性的產生，磷化氫的防治效果也越來越差[32-34]．因此探索新型的熏蒸劑來減少對磷化氫的依賴性非常重要．之前的研究表明，硫酰氟與磷化氫并無交互抗性作用，能夠作為防治磷化氫抗性的一種替代藥劑[10-11]；臭氧[35]、甲酸乙酯[12-13]等同樣也可以作為對抗磷化氫抗性的可選擇熏蒸劑；而二硫化碳作為一種熏蒸劑，具備穿透性好、殺蟲效果好等特點，能夠有效地防治赤擬谷盜等倉儲害蟲[36]．本試驗旨在探索二硫化碳與磷化氫是否具有交互抗性，并探索二硫化碳處理后赤擬谷盜代謝以及解毒酶的變化，從而判斷二硫化碳能否可以成為對抗磷化氫抗性的一種新藥劑．

本試驗首先通過FAO推薦的測定磷化氫抗性的方法，根據Jagadeesan R等[10]測定的敏感品系，得出AU品系的抗性倍數為7.1，QH品系的抗性倍數為38.1，ZB品系的抗性倍數為458.6，SZ品系的抗性倍數為1 022.0，能夠覆蓋低抗、中抗、極高抗3個等級．本試驗中二硫化碳毒力數據LD50的CT值(熏蒸時間×熏蒸濃度)分別是AU為356.56 mg·h/L，QH為385.72 mg·h/L，ZB為342.56 mg·h/L，SZ為338.56 mg·h/L．根據Jagadeesan R等[10]測定的數據，使用硫酰氟熏蒸2種不同抗性水平的赤擬谷盜，LD50的CT值分別為6.72 mg·h/L和8.16 mg·h/L．根據唐培安等[37]測定的數據，使用甲酸乙酯熏蒸赤擬谷盜，LD50的CT值為660.38 mg·h/L，因此可以看出二硫化碳對于倉儲害蟲成蟲殺蟲效果低于硫酰氟，高于甲酸乙酯．

本試驗測定了4種不同品系赤擬谷盜熏蒸前后的呼吸強度，在熏蒸之前可以看出，低抗品系的呼吸強度高于抗性品系的呼吸強度，這與Price等[38]的研究結果相似．而在熏蒸過程中赤擬谷盜的呼吸強度降低，并且各個品系之間差異無統計學意義，而在熏蒸之后4種品系的呼吸強度均有明顯提高，說明在熏蒸之后赤擬谷盜體內的整體代謝水平提高，以對抗二硫化碳對自身的傷害．

解毒酶對殺蟲劑的代謝解毒能力是研究昆蟲對殺蟲劑脅迫相應機制的主要途徑之一．本試驗還測定了4種不同磷化氫抗性品系的赤擬谷盜體內解毒酶的表達水平．研究結果發現，P450s的活性在二硫化碳處理前后低抗AU品系P450s活性顯著升高，而中、高抗品系QH，SZ品系P450s活性顯著降低，此結果與HUANG等[39]以亞致死濃度磷化氫處理赤擬谷盜后敏感品系P450s活性顯著降低、而抗性品系P450s活性顯著升高的結果對比，說明磷化氫與二硫化碳的殺蟲機理不同，也進一步論證了二硫化碳和磷化氫之前沒有交互抗性，并與其試驗結論赤擬谷盜中P450s活性與磷化氫抗性水平有關相似．本試驗4種品系赤擬谷盜中CarE和AChE活性在經過二硫化碳處理后均顯著提高；而在唐培安等[37]的研究中，使用甲酸乙酯熏蒸處理米象后，米象體內的AChE和CarE活性顯著降低；徐麗[40]的研究也表明，甲酸乙酯能夠抑制酯酶的活性和AChE的活性，說明二硫化碳的殺蟲機理和另一種磷化氫的替代性熏蒸劑甲酸乙酯的殺蟲機理也是不同的．處理前后3種酶均有顯著性變化，AChE，CarE，P450s 3種解毒酶能夠參與赤擬谷盜對二硫化碳的代謝過程．

替代性熏蒸劑的篩選在國內外已經做了較多的研究，其中最重要的2種是硫酰氟和甲酸乙酯．硫酰氟已經被證實與磷化氫之間沒有交互抗性[11]，并且，硫酰氟在熏蒸處理赤擬谷盜上也能夠有很好的效果[41]．但是硫酰氟熏蒸的缺點也同時限制了其大規模推廣使用，首先硫酰氟熏蒸完全殺死卵所需要的濃度較高，其次，在溫度低于25 ℃，硫酰氟的熏蒸效果會大大削減[10-11]，這就導致使用硫酰氟熏蒸處理時所需要的成本比使用磷化氫高許多．另一種熏蒸劑甲酸乙酯也是一種非常常見的替代性熏蒸劑，被證實可以有效地熏蒸干果和谷物[42-44]以及西花薊馬[43]、煙薊馬[45]等有害生物，但有報道指出，甲酸乙酯雖然熏蒸時間較短，但是能夠對許多植物和水果包括南瓜、香蕉、香菜等造成損傷[46-47]．而本試驗用的二硫化碳，根據徐國淦等[19]的研究表明，其在熏蒸水果的過程之中，不易造成藥害及對外觀及品質等的影響；雖然該藥毒性較低，但是穿透效果較好[36]，并且從效率和成本上來說二硫化碳是最有效的糧食熏蒸劑之一．目前國內外還沒有關于氮氣與二硫化碳混合使用的報道，但在實際應用中氮氣與磷化氫混合技術已經成熟[47]，使用氮氣不但能夠實現更安全地投藥，而且還有一定的增效效果，因此之后可以探索氮氣與二硫化碳混合技術．總之，開發出一種類似于溴甲烷或者磷化氫的廣譜性熏蒸劑是非常困難的，在這種情況下，不同替代性熏蒸劑的開發往往是針對于特定水果、特定昆蟲和特定食品的．本試驗針對倉儲害蟲，利用二硫化碳熏蒸處理不同磷化氫抗性的赤擬谷盜，發現二硫化碳與磷化氫之間沒有交互抗性，為對抗倉儲害蟲磷化氫抗性的發展提供了新的思路．