QuEChERS-GC-MS/MS法測定淡水魚中6種擬除蟲菊酯的殘留量

楊金川，白雪梅，張 建，宋忠霞，彭祖茂

（1.貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省廣告監測中心，貴州 貴陽 550001）

擬除蟲菊酯是一類高效廣譜、低毒、低殘留新型殺蟲劑，其殺蟲效率是有機氯、有機磷、氨基甲酸酯類的10～100倍，因此廣泛運用于農業、林業等生產中，但隨著在農業、林業生產上的施用，其殘留物會在農田排水、地表徑流、降水等進入水體后，并通過食物鏈最終進入人體，會給人類健康帶來嚴重隱患。有研究表明，當擬除蟲菊酯類農藥在人體內長期積蓄時，會對人體的聽力系統[1]、神經系統[2-3]、生育系統[4-5]等產生較大的危害。隨著對擬除蟲菊酯類殘留危害的關注，很多國家和地區，逐漸加強了對一些水產品中擬除蟲菊酯類的限量，如國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）規定了鮭肌肉中溴氰菊酯最高殘留限量為30 μg/kg；歐盟（European Union，EU）規定了水產品中氯氰菊酯和溴氰菊酯最高殘留量分別為50 μg/kg和10 μg/kg；美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）規定了魚類中溴氰菊酯最高殘留量為10 μg/kg[6]；而我國在食品安全國家標準GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中也規定了魚肌肉中氯氰菊酯和溴氰菊酯最大殘留限量，為分別為50 μg/kg和30 μg/kg。隨著對一些水產品中擬除蟲菊酯類殘留危害的關注以及對氯氰菊酯和溴氰菊酯的限量，因此需要加強對擬除蟲菊酯類在魚類產品中的檢測研究。

目前，對擬除蟲菊酯類農藥的殘留檢測技術很多，主要有酶聯免疫分析方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[7-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10-14]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15-17]、液相色譜-質譜/質譜（liquidchromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[18-19]和氣相色譜-質譜/質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[20-21]。而前處理方法技術主要有固相萃取法（solid phase extraction，SPE），分散固相萃取法（dSPE）等。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術是2003年ANASTASSIADES M等[22]首次提出，是在固相萃取基礎上發展起來的一種新型前處理凈化方法，其原理是通過吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質而達到除雜的目的，因其前處理簡單、快速，耗費有機試劑少，對環境友好等特點，經多年發展，現已成動植物性食品中農獸藥殘留的主要前處理技術之一。

魚肉基質復雜，其含有豐富的蛋白質、脂肪、氨基酸、維生素以及礦物質等，并且魚肉中有機基質在前處理過程中較難去除干凈，所以會對菊酯類農藥檢測帶來很大困難。本研究以貴州市售淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）為研究對象，通過應用QuEChERS前處理技術，結合高靈敏度，高抗基質干擾能力的氣相色譜-串聯質譜儀，對淡水魚中6種擬除蟲菊酯的定量進行研究，篩選出適宜的定性離子和定量離子，優化方法條件，實現對6種擬除蟲菊酯類殘留的快速檢測，以期為魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水魚：市售。

氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、聯苯菊酯標準溶液（100 mg/L）、環氧七氯（內標）標準溶液（100 mg/L）：農業部環境保護科研監測所；N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）（粒徑為40～63 μm）和十八烷基鍵合硅膠（C18，粒徑為40 μm）：美國Agilent公司；乙酸乙酯（色譜純）：默克公司；無水硫酸鎂（分析純）：永大試劑有限公司；乙腈和氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TRACE 1300-TSQ 9000氣相色譜三重四極桿串聯質譜、ThermoScientific TR-Pesticide Ⅱ色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Thermo Scientific公司；ME1002/02分析天平：梅特勒-托利多國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

淡水魚去鱗、去骨后，取肌肉組織勻漿處理，放入聚乙烯瓶中，于-20 ℃保存備用。

1.3.2 樣品的前處理

稱取勻漿處理的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，先加2 mL超純水混勻，加入乙腈10 mL勻漿提取5 min，再加入2～3 g NaCl振蕩提取2 min，然后以5 000 r/min離心5 min，待取上清液，凈化；取4 mL上述上清液于15 mL聚丙烯QuEChERS凈化管（500 mg MgSO4+150 mg PSA+150 mg C18）中，渦旋振蕩1 min，6 000 r/min離心5 min，然后取2 mL離心上清液于玻璃試管中，45 ℃水浴中，氮吹吹至近干，用1 mL乙酸乙酯定容后，再加入20 μL 2.5 μg/mL的環氧七氯（內標），渦旋混合復溶，過0.22 μm濾膜到進樣小瓶中，待GC-MS/MS檢測。

1.3.3 分析方法

（1）氣相色譜檢測條件

石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：Thermo Scientific TR-Pesticide Ⅱ；載氣：氦氣（He），純度≥99.999%，流速1.00 mL/min；不分流進樣；進樣體積1 μL；進樣口溫度為250 ℃。程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min 升至120 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，最后以12 ℃/min 升至300 ℃，保持6 min。

（2）質譜檢測條件

電子轟擊離子源（electron bombardment ion source，EI），溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：氬氣（99.999%）；選擇反應檢測掃描（selection response monitor，SRM）模式。

上述條件下，各化合物的保留時間、定性及定量離子、碰撞能量等信息見表1。

表1 6種擬除蟲菊酯的CAS號、保留時間、定性和定量離子以及碰撞能量Table 1 CAS No.,retention time,qualitative and quantitative ions,and collision energy of 6 pyrethroids

續表

1.3.4 基質效應評價及標準曲線繪制

本研究采用空白基質提取液與純溶劑配制成相同濃度，用以比較待測目標物的峰面積，通過二者峰面積的相對比值評價基質效應（matrix effect，ME），如果ME＞100%，說明存在基質增強效應，ME值越大，基質增強效應越大；如果ME＜100%，說明存在基質抑制效應，ME值越小，基質抑制效應越強[23]。ME計算公式如下：

式中：A表示純溶劑中目標物峰面積；B表示相同濃度下樣品基質中目標物峰面積。

分別移取上述一定量標準溶液至10 mL容量瓶中，然后用乙酸乙酯稀釋定容，配制成各農藥質量濃度為2 mg/L的標準混標儲備液，于-20 ℃保存，備用。試驗時，用對應基質空白溶液逐級稀釋，配成質量濃度為5 μg/L、10 μg/L、30 μg/L、60 μg/L、150 μg/L、300 μg/L的一系列基質匹配標準工作溶液，并加入內標，在1.3.3節分析條件下進行測定。以目標物定量離子的峰面積（y）為縱坐標，進樣質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸分析。

1.3.5 加標回收率試驗

向空白樣品中（鯉魚、草魚、鳙魚）添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg的擬除蟲菊酯，進行回收率和精密度實驗，每個添加水平5個重復，計算回收率和精密度。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

為了獲得最佳的SRM質譜條件，在選定的氣相條件下，對各化合物先進行單級質譜全掃描（50～500 m/z），分別獲得了其保留時間和具有代表性的母離子碎片，然后再采用產物離子掃描方式通過優化碰撞能量及選擇的母離子碎片擊碎獲得產物離子，得到了1.3.3節中較為理想的質譜檢測條件和SRM色譜圖，6種菊酯的GC-MS/MS色譜圖見圖1，其優化后的峰型對稱較好，雖然聯苯菊酯和甲氰菊酯出峰時間較相近，但兩者對應的母離子碎片及產物離子碎片都不同，檢測器會逐個離子分開掃描，所以對后期的定量定性均不會產生任何影響。

圖1 6種擬除蟲菊酯的GC-MS/MS選擇離子流色譜圖Fig.1 Selective reaction monitoring of 6 pyrethroids by GC-MS/MS

2.2 提取、凈化條件選擇

2.2.1 提取試劑的優化

本研究先后考察了丙酮、乙酸乙酯和乙腈3種常用的農殘提取試劑對提取效果的影響，結果表明，丙酮提取的雜質較多，不利于后續進行分離凈化處理；乙酸乙酯作為提取試劑由于無法浸入魚肉組織內部，導致回收率不高；乙腈作為提取試劑，因其良好的共萃和分層特性，為后續的分離凈化提供方便，并且擁有良好的回收率。因此本研究選用乙腈作為提取試劑。

2.2.2 凈化條件的選擇

QuEChERS中常用到的吸附劑填料主要有石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、PSA、C18和MgSO4[24-25]，由于魚肉中含有豐富的蛋白質、脂肪及氨基酸等，所以混合使用PSA、C18和MgSO4，可以達到更好的凈化效果，但吸附劑用量會對回收率有一定的影響。所以本研究以在添加量為30 μg/kg鯉魚肉樣品為例，按1.3.2方法前處理提取，凈化時分別用考察的6種凈化組合凈化，再按1.3.3分析方法檢測，考察6種不同的凈化組和對各擬除蟲菊酯的回收率的影響，結果見圖2。

圖2 鯉魚中6種擬除蟲菊酯在6種凈化劑中的回收率Fig.2 Recovery of 6 pyrethroids spiked in carp in six purifying agents

由圖2可知，當組合為Ⅰ和Ⅱ時，于PSA和C18吸附劑用量較少，雖然各擬蟲菊酯的回收率較高，但并通過總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）對比發現，雜質去除效果較差；當組合為Ⅲ～Ⅵ時，通過TIC圖對比發現，均能達到很好的凈化效果，但當隨著吸附劑用量的增加，聯苯菊酯的回收率降低明顯。最終，在綜合凈化效果、滿足各菊酯的回收率的同時降低實驗成本，最終選擇組合Ⅲ（PSA 150 mg+C18 150 mg+MgSO4500 mg）作為凈化吸附劑。

2.3 基質效應、標準曲線、檢出限及定量限

以各質量濃度為30 μg/L的標液為例，分別配制基質匹配標準溶液和純溶劑標液，并采用1.3.4中基質效應的評價公式進行基質效應評價，按1.3.4節配制基質匹配標準溶液，用GC-MS/MS檢測并繪制標準曲線，其線性范圍、決定系數、基質效應、檢出限和定量限結果見表3。

表3 6種擬除蟲菊酯的線性范圍、決定系數、基質效應、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients,matrix effect,LODs and LOQs of 6 pyrethroids

由表3可知，6種擬除蟲菊酯在3種魚肉基質中的ME在186%～335%之間，均存在較強的基質增強。為了減小基質效應的影響[28]，本研究采用基質匹配標準曲線（內標法）進行定量。在線性范圍內，6種菊酯的峰面積與對應的進樣質量濃度間均呈良好的線性關系，決定系數R2均大于0.999 5。以被測化合物定量離子對3倍信噪比（S/N）確定的方法檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N）確定的方法定量限（limit of quantitation，LOQ）分別在0.2～1 μg/kg和0.6～3 μg/kg之間。

2.4 方法的精密度與加標回收率

當空白樣品中添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg，且每個添加水平5個平行時，測定加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviations，RSD），結果見表4。結果表明，6種擬除蟲菊酯在魚肉中的平均回收率在83%～102%之間，相對標準偏差在0.9%～4.9%之間。表明所建立方法具有良好的準確度、精密度和重復性。

表4 6種擬除蟲菊酯在淡水魚中3個水平下的加標回收率及相對標準偏差（n=5）Table 4 Recovery and RSD of 6 pyrethroids at three spiked levels in freshwater fish (n=5)

續表

2.5 實際淡水魚樣品中6種擬除蟲菊酯的測定

從貴陽市各超市和農貿市場隨機購買鱘魚、鰱魚、鯉魚等30份樣品，按照優化的前處理方法和色譜條件進行檢測，結果均未檢出6種擬除蟲菊酯的殘留。

3 結論

本研究通過提取溶劑和吸附劑的篩選得以優化QuEChERS前處理條件，并采取較優的GC-MS/MS條件，建立了一種快速測定淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）中6種擬除蟲菊酯殘留的分析方法。本研究對基質效應進行了考察，并通過配制基質匹配標準曲線可以減少基質效應影響，從而實現了復雜基質的提取、凈化濃縮與多種菊酯類殘留的快速篩查及確證，能滿足淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）中6種菊酯的快速定性和定量檢測，也可為其他淡水魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術支持。