HPLC 法測定對乙酰氨基酚原料藥有關物質及遺傳毒性雜質

趙淑晶，高永堅，區淑蘊，劉勇，梁鳳友，肖艷

（國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528303）

對乙酰氨基酚為乙酰苯胺類解熱鎮痛藥，具有良好的解熱、鎮痛作用，在世界上廣泛應用。分析各國藥典質量標準及對乙酰氨基酚原料的合成工藝確認已知雜質共有15 個（見表1），其中對氯苯乙酰胺（雜質J）和對氨基酚（雜質K）為已列入《中國藥典》（ChP2020）、《英國藥典》（BP2022）、《美國藥典》（USP43）標準的雜質，雜質A、雜質B、雜質D為已列入《美國藥典》（USP43）標準的雜質；另參考文獻[2-3]可知：雜質C、雜質E、雜質G 和雜質I 是以對羥基苯乙酮為原料合成對乙酰氨基酚的過程中產生的雜質，雜質H、雜質L、雜質M、雜質N、雜質F、雜質O均為以對氨基酚為原料合成對乙酰氨基酚的過程中引入的工藝雜質。

表1 對乙酰氨基酚原料中已知雜質Table 1 Known impurities in Acetaminophen API

通過查詢致癌性數據庫（carcinogenicity potency database,CPDB）及文獻[4-5]，確定對硝基氯苯（雜質O）和對硝基苯酚（雜質F）為遺傳毒性雜質。根據2020 年版《中國藥典》四部通則9306 遺傳毒性雜質控制指導原則、國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）M7（R1）和Q3D指導原則，對乙酰氨基酚每天總劑量不超過2 g，對硝基氯苯限度按473 mg/（kg·d）計算（CPDB），限度要求為0.02%，對硝基苯酚限度按13.8 mg/（kg·d）計算(未觀察到作用劑量，noobserved effect level,NOEL[4]），限度要求為0.06%。

目前，尚未有同時檢測對乙酰氨基酚原料多種有關物質及遺傳毒性雜質的文獻報道。本研究建立了對乙酰氨基酚原料中有關物質及遺傳毒性雜質的測定方法，對其中9 個已知雜質（雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質H、雜質J、雜質K、雜質O）進行測定，為本品質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A、LC-2010A 型高效液相色譜儀（島津科技有限公司）；色譜柱：SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 μm，依利特）、Ultimate AQ-C18（4.6 mm×200 mm，5μm，月旭）。

對乙酰氨基酚原料藥[河北冀衡（集團）藥業有限公司，批號011805003、011806176、011806177；對乙酰氨基酚（批號100018-201610）、對氨基酚（批號100802-201604）、對氯苯乙酰胺（批號100850-201803）來自中國食品藥品檢定研究院；雜質A（批號8-ANR-29-1）、雜質C（批號5-SCC-154-1）、雜質H（批號7-ABY-121-1）、對硝基苯酚（批號11-MWC-191-1）來自Toronto Research Chemicals（TRC）；雜質B（批號20-HPE-04Y3）、雜質D（批號38-END-12Y3）來自STC Research Chemicals Ltd；對硝基氯苯（批號H1313034）來自阿拉丁。甲醇為色譜純，醋酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液的制備 精密稱取對乙酰氨基酚對照品適量，用40%（體積分數，下同）甲醇制成對乙酰氨基酚儲備液（54.3μg/mL）。

精密稱取對氨基酚對照品適量，用40%甲醇制成對氨基酚儲備液①（541μg/mL）；精密量取2 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對氨基酚儲備液②（5.41μg/mL）。

精密稱取對氯苯乙酰胺對照品適量，用甲醇制成對氯苯乙酰胺儲備液①（208.2μg/mL）；精密量取1 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對氯苯乙酰胺儲備液②（1.041μg/mL）。

精密稱取對硝基氯苯對照品適量，用甲醇制成對硝基氯苯儲備液①（454.3μg/mL）；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對硝基氯苯儲備液②（45.4μg/mL）。

精密稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質H、對硝基苯酚對照品適量，用40%甲醇制成含雜質A（100.4 μg/mL）、雜質B（104.5 μg/mL）、雜質C（109.4 μg/mL）、雜 質D（106.6 μg/mL）、雜 質H（113.6 μg/mL）和對硝基苯酚（133.2 μg/mL）的混合對照品儲備液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密量取對乙酰氨基酚對照品儲備液2 mL、混合對照品儲備液1 mL、對硝基氯苯儲備液②1 mL、對氨基酚儲備液②2 mL、對氯苯乙酰胺儲備液②2 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇制成約含對乙酰氨基酚10 μg/mL、雜質A 10μg/mL、雜質B 10μg/mL、雜質C 10μg/mL、雜質D 10μg/mL、雜質H 10μg/mL和對硝基苯酚12μg/mL、對硝基氯苯4 μg/mL、對氨基酚1 μg/mL、對氯苯乙酰胺0.2μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取對乙酰氨基酚原料藥適量，精密稱定，加40%甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 mg的溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（4.6 mm×200 mm,5μm）；檢測波長為245 nm，柱溫為35 ℃。以0.05 mol/L 醋酸銨為流動相A，甲醇為流動相B，流速1.0 mL/min，按表2進行梯度洗脫，進樣量20 μL。

表2 流動相洗脫梯度Table 2 Mobile phase elution gradient

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 取“2.1.2”項混合對照品溶液作為系統適用性試驗溶液，按“2.2”項色譜條件進樣分析，結果見圖1 及表3。可見，各雜質與主成分（對乙酰氨基酚）的分離度以及各雜質間的分離度均大于1.5，表明該色譜條件專屬性良好。

表3 對乙酰氨基酚與各雜質的保留時間和分離度Table 3 Retention time and separation of acetaminophen and impurities

圖1 系統適用性試驗色譜圖Figure 1 Chromatogram of system suitability test

2.3.2 耐用性試驗 在選定的色譜條件下，微小改變流動相比例（醋酸銨濃度0.04～0.06 mol/L）、流速（0.8～1.2 mL/min）、柱溫（30～40 ℃）及選用同規格型號但不同批號的依利特（E2917651、E3020745）、不同品牌（月旭，221701657）色譜柱后，分別取“2.1.2”項混合對照品溶液進行試驗，結果顯示：不同條件下，各雜質與主成分（對乙酰氨基酚）的分離度以及各雜質間的分離度均大于1.5，表明選定的色譜條件耐用性良好。

2.3.3 線性范圍 精密稱取對氯苯乙酰胺、對硝基氯苯對照品適量，分別用甲醇制成對氯苯乙酰胺儲備液（233.6μg/mL）、對硝基氯苯儲備液（454.3μg/mL）；另精密稱取對乙酰氨基酚、對氨基酚、對硝基苯酚對照品適量，用40%甲醇制成乙酰氨基酚儲備液（52.3 μg/mL）、對氨基酚儲備液（549.5 μg/mL）、對硝基苯酚儲備液（125.1μg/mL），上述儲備液用40%甲醇稀釋制成一系列濃度溶液，按“2.2”項色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積（y）對質量濃度（x）進行線性回歸，結果見表4。

表4 線性范圍試驗結果Table 4 Results of linear range

2.3.4 檢出限和定量限試驗 取“2.1.1”和“2.3.3”項下對照儲備液適量，用40%甲醇逐級稀釋，依法測定，以信噪比為3∶1時計算檢測限，以信噪比為10∶1時計算定量限，結果詳見表5。

表5 檢出限和定量限試驗結果Table 5 Results of detection limit and quantitation limit

2.3.5 精密度試驗 取“2.1.2”項混合對照品溶液按“2.2”項色譜條件連續進樣測定6 次，以峰面積計算RSD，結果在0.1%～8.1%之間，小于10%，表明方法精密度良好，見表6。

2.3.6 穩定性試驗 參照“2.1.2”項混合對照品溶液配制方法，配制除對乙酰氨基酚外的雜質混合對照溶液，分別置于室溫（10～30 ℃）和冰箱（4～6 ℃）中，室溫于0、4、8、12、24 h 時取樣，冰箱于0、17、40、78 h時取樣，依法測定，計算峰面積RSD，結果顯示，除在室溫、24 h 和冰箱、78 h 時，對氨基酚和對硝基氯苯的峰面積RSD 值大于2%外，其他雜質對照RSD值均小于2%，見表7。

取一批次樣品（批號011912026），按“2.1.3”項配制供試品溶液，“2.1.4”項配制對照溶液，并按“2.2”項色譜條件進樣分析，供試品溶液在室溫、24 h及冰箱、78 h內各時間點雜質含量與0 h比較。外標法計算對氨基酚、對氯苯乙酰胺、對硝基苯酚、對硝基氯苯，均未檢出；不加校正因子的主成分自身對照法計算其他雜質，最大單雜和總雜含量變化的絕對值小于0.02%，表明溶液穩定。

2.3.7 重復性試驗 取一批次樣品（批號011912026），按“2.1.3”項供試品溶液和“2.1.4”項對照溶液方法制備，平行6 份，并按“2.2”項色譜條件進樣測定；由不同的分析人員，使用不同的儀器和不同批號的色譜柱在不同日期進行另外6 份供試品溶液測定，綜合12 次測定結果，均未檢出對氨基酚、對氯苯乙酰胺、對硝基苯酚和對硝基氯苯，最大單雜和總雜含量變化的絕對值小于0.02%，表明方法重復性良好。

2.3.8 回收率試驗 精密稱取9 份對乙酰氨基酚原料藥（批號011912026）0.4 g，分別精密加入“2.3.3”項對照品溶液適量，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液9 份，按“2.2”項色譜條件進樣分析，根據“2.3.3”項下的線性回歸方程計算各濃度準確度溶液的測定得量，計算回收率，結果見表8。

表8 回收率試驗結果Table 8 Results of recoveries

2.4 樣品的測定

取3 批對乙酰氨基酚原料（批號：011805003、011806176、011806177）依法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.2”項色譜條件進樣分析，結果顯示：3批原料中對氯苯乙酰胺的檢測結果分別為未檢出、0.001%、0.001%；對氨基酚的檢測結果分別為未檢出、未檢出、0.001%；其他單雜的檢測結果分別為0.02%、0.02%、0.02%；總雜的檢測結果分別0.04%、0.03%、0.03%；3批均未檢測出對硝基氯苯（檢測限：0.061 μg/mL）和對硝基苯酚（檢測限：0.053 μg/mL）。

3 討論

3.1 方法的優化

對比各國藥典收載的對乙酰氨基酚原料有關物質檢測方法，ChP2020 和USP43 均需使用2 個液相方法測定有關物質，BP2022 雖然只使用1 個液相方法檢測，但只檢測了對氨基酚和對氯苯乙酰胺，其他特定雜質的檢出能力未知，且規定的C18柱（100 mm×2.1 mm, 2.7 μm）一般要使用超高效液相測定，普通液相不適用。而本研究建立的方法可以使用普通液相同時檢測9 種已知雜質，方法簡便快捷，檢驗效率高，推廣性好。

3.2 特定雜質的確定

比較各國藥典中收載的對乙酰氨基酚原料藥的質量標準，對于已知雜質，除USP43規定了5種雜質的限度外，ChP2020、BP2022 均只規定了對氨基酚、對氯苯乙酰胺的限度。本研究建立的方法可以同時檢測9 種已知雜質，但從節約檢驗成本角度出發，建議日常檢驗將對氨基酚、對氯苯乙酰胺作為特定雜質控制，其他雜質作為未知單雜控制。另外，為確保產品的安全性，建議增加對遺傳毒性雜質（對硝基苯酚、對硝基氯苯）的控制。

3.3 雜質限度的確定

參考各國藥典中收錄的雜質及限度，并遵循從嚴原則，暫定普通雜質限度標準：按外標法以峰面積計算，對氨基酚不得過0.005% ，對氯苯乙酰胺不得過0.001%；不加校正因子的主成分自身對照法計算其他單個雜質，不得過0.05%；各雜質之和（即總雜）不得超過0.1%。另針對遺傳毒性雜質，結合前面計算的限度要求，建議設定限度標準：按外標法以峰面積計算，對硝基氯苯不得過0.02%；對硝基苯酚不得過0.06%。

本研究建立的方法能同時檢測對乙酰氨基酚原料中有關物質（對氨基酚、對氯苯乙酰胺、雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質H）及遺傳毒性雜質（對硝基苯酚、對硝基氯苯）的含量，線性關系與精密度均良好，方法準確度高，檢測下限與定量下限能滿足分析要求，此方法彌補了藥典中原料有關物質檢測項的不足，確保了產品的安全性。