HPLC法測定阿伐那非對映異構體的研究

劉元芬，葉星辰，王糾

（1.江蘇衛生健康職業學院，江蘇 南京 211800；2.廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東 廣州 510006；4.廣東省藥物緩控釋制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006；5.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

阿伐那非（avanafil）是一種口服速效的高選擇性磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑，能抑制環磷酸鳥苷在體內的代謝，從而使平滑肌的舒張作用得以加強，陰莖的血流量增加，進而幫助勃起，用于治療男性勃起功能障礙（ED）[1-3]。阿伐那非具有與其他PDE5 抑制劑相同的作用機制，但口服吸收更快，大多數ED患者在使用本品后0.5 h內即能成功進行性生活，等效或優于目前市場上的其他PDE5 抑制劑[4]，如西地那非（商品名：偉哥）、伐地那非（商品名：艾力達）、他達拉非（商品名：西力士）等。美國FDA 于2012 年4月批準阿伐那非上市，并于2013年由Vivus 授權Auxilium 在美國進行銷售，商品名為Stendra[5]。

阿伐那非原研藥（C23H26ClN7O3）結構為(S)-4-[(3-氯-4-甲氧基芐基)氨基]-2-[2-(羥甲基)-1-吡咯烷基]-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲磺酰胺。阿伐那非在合成過程中引入L-脯胺醇手性分子，得到中間體4-[（3-氯-4-甲氧基苯基）甲氨基]-2-[（S）-2-羥甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸乙酯（中間體3，圖1），因此在結構中具有一個手性分子中心，構型為S型，其結構和R型對映異構體結構見圖2[6-8]。

圖1 阿伐那非手性結構的產生Figure 1 Formation of avanafil isomers

圖2 阿伐那非（A）與阿伐那非對映異構體（B）的化學結構式Figure 2 The chemical structure of S-avanafil(A)and R-avanafil(B)

阿伐那非對映異構體雖然與阿伐那非分子式相同，但S型是活性成分，R型對映異構體卻是合成中的雜質。目前，關于阿伐那非的含量測定方法已有文獻報道[9-13]，但未見有采用HPLC 法測定阿伐那非對映異構體的報道，因此，本文擬建立HPLC法對阿伐那非對映異構體進行測定，為阿伐那非仿制藥的質量標準研究和上市研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent g1314A VWD 檢測器（美國安捷倫公司）；CHIRALCEL OD-H 色譜柱（日本DAICEL 大賽璐公司，Lot:No.ODH0CE-PH042,5 μm,4.6 mm×250 mm）；ME104 電子分析天平（瑞士梅特勒，十萬分之一）。

1.2 材料

乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；正己烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；L-脯胺醇（分析純，泰州精英化成醫藥科技有限公司）；水為娃哈哈純凈水；阿伐那非對照品（批號：20180802，供含量測定用）、阿伐那非對映異構體對照品（批號：20181029，供含量測定用）和阿伐那非樣品（批號20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815）均為自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent 1100 高效液相色譜儀；Agilent g1314A VWD 檢 測 器；Agilent Chemstation 色 譜 工 作 站；CHIRALCEL OD-H 色譜柱；流動相：正己烷-乙醇（體積比82∶18）；檢測波長：233 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

阿伐那非供試品溶液：取制備的阿伐那非原料藥適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL約含阿伐那非400 μg的溶液。

阿伐那非對映異構體對照品儲備液A：取阿伐那非對映異構體對照品適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL 約含阿伐那非対映異構體400 μg的溶液。

阿伐那非對映異構體對照品溶液：取阿伐那非對映異構體對照品儲備液A 0.5 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋制成每1 mL約含阿伐那非對映異構體2 μg的溶液。

系統適用性溶液：精密稱取阿伐那非和阿伐那非對映異構體適量，置同一容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL約含阿伐那非400 μg、阿伐那非對映異構體2 μg的混合溶液。

阿伐那非對映異構體專屬性試驗溶液：取阿伐那非對映異構體對照品儲備液A 1.0 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至含阿伐那非對映異構體4 μg/mL。

2.3 專屬性試驗

精密吸取空白溶液、阿伐那非對映異構體專屬性試驗溶液和系統適用性溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖3。可見，阿伐那非對映異構體和阿伐那非的保留時間分別為24.32 min和21.14 min，兩者達到有效分離，分離度為2.4，理論塔板數為4745，表明方法專屬性好。

圖3 阿伐那非異構體專屬性試驗圖譜Figure 3 Chromatogram of specificity test

2.4 耐用性試驗

分別考察流動相比例、流速、波長和柱溫等因素以調整色譜條件，精密量取阿伐那非供試品溶液和系統適用性溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察異構體分離情況，結果見表1。可見，對原色譜條件中的波長、柱溫、流速及流動相比例在一定范圍內進行調整，系統適用性溶液中對映異構體與阿伐那非主成分色譜峰間的分離無明顯差異，分離度大于1.5，溶液中對映異構體檢測質量分數約為0.42%；阿伐那非供試品溶液中均未檢出對映異構體，雜質檢出無明顯差異。

表1 耐用性試驗結果Table 1 Results of durability test

2.5 定量限和檢測限的測定

阿伐那非對映異構體的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）按“2.1”項下色譜條件，根據信噪比法確定。用無水乙醇逐級稀釋成不同濃度進行測定，當峰面積為9.67，其信噪比為10 左右，這時計算的濃度即為最低定量限濃度，當信噪比為3 左右時即為最低檢測限濃度。結果測得阿伐那非對映異構體的定量限為0.10 μg/mL，檢測限為0.033 μg/mL。

2.6 線性關系考察

精密稱取阿伐那非及其對映異構體各約10 mg，分別置2個20 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密移取1.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液儲備液。分別精密移取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、6.0 mL 置9 個10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性關系考察溶液。

按“2.1”項下色譜條件，精密量取各線性溶液20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質量濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程并繪制標準曲線。結果顯示，阿伐那非質量濃度在0.10～6.05 μg/mL 范圍內與峰面積成線性相關，線性方程為Y=76.757X+2.8889，r=0.9999；阿伐那非對映異構體質量濃度在0.10～6.03 μg/mL 范圍內與峰面積成線性相關，線性方程為Y=77.23X+2.592，r=0.9999。線性方程截距均小于100%響應值的20%，響應因子RSD 值小于10%，表明線性關系良好，符合試驗要求。

2.7 穩定性試驗

按“2.1”項色譜條件，分別于0、1、2、4、8、12、24 h精密量取阿伐那非供試品溶液及阿伐那非對映異構體對照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液及異構體溶液的穩定性。結果顯示，阿伐那非供試品溶液室溫下放置24 h，主峰峰面積未見明顯減小，峰面積RSD值為0.32%，同時未檢出阿伐那非對映異構體；阿伐那非對映異構體溶液室溫放置24 h，主峰峰面積未見明顯減小，峰面積RSD值為0.42%，表明在該檢測色譜條件下，阿伐那非及其對映異構體溶液室溫條件下24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗和精密度試驗

精密吸取阿伐那非對映異構體對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣6 針，測定峰面積平均值及計算RSD 值，結果顯示峰面積平均值為32.97，RSD 值為1.9%，表明方法重現性良好。

為了考察隨機變動的因素對精密度的影響，中間精密度試驗由甲、乙兩人分別獨立建立系統，使用同品牌不同的儀器，在不同的日期，按“2.1”項下色譜條件測定同一批阿伐那非對映異構體對照品溶液濃度，結果測得峰面積RSD 值均低于1%，表明方法中間精密度較好。

2.9 回收率試驗

精密稱取阿伐那非對映異構體對照品，依法配置成質量濃度約為0.5 mg/mL 的標準母液，然后分別精密移取該標準母液0.32、0.40、0.48 mL 置100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為回收率試驗80%（低）、100%（中）及120%（高）溶液。稱取阿伐那非對照品約10 mg，置25 mL 量瓶中，平行稱取9 份，分別用上述回收率低、中、高溶液溶解并稀釋至刻度，每個濃度平行配制3份，分別精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，代入標準曲線方程按外標法計算回收率。結果見表2。可見，低、中、高質量濃度的阿伐那非對映異構體溶液的回收率在97.21%～100.41%范圍內，RSD均小于1.0%，表明方法準確度較好，符合方法學考察要求。

表2 阿伐那非對映異構體回收率試驗結果Table 2 Results of recovery test of avanafil isomer

2.10 自制樣品中對映異構體的測定

取6 批樣品（20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815），按“2.2”項方法配制阿伐那非供試品溶液，精密量取20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由于阿伐那非異構體的含量低于檢測限，6批樣品均未檢測出對映異構體。

3 討論

3.1 最大吸收波長的選擇

阿伐那非和阿伐那非對映異構體以正己烷-乙醇（體積比82∶18）為溶劑，在200～400 nm 波長范圍進行紫外掃描，結果顯示阿伐那非對映異構體在233 nm 波長處有最大吸收，阿伐那非在236、266、310 nm 波長處有最大吸收。因此，確定233 nm 為檢測波長。

3.2 對映異構體旋光性的測定

阿伐那非為S型異構體，其對映異構體為R 型。經檢測阿伐那非的旋光度為-78～-84o，阿伐那非對映異構體旋光度為78～84o。少量對映異構體對旋光度的影響不顯著，對阿伐那非質量控制時，在其旋光度檢測合格后再通過HPLC 法進行檢測，可以更加準確地控制阿伐那非對映異構體的量。

對映體具有相同的物理性質（如熔點、沸點、溶解度）、熱力學性質（如自由能、焓、熵）和化學性質等，但它們對偏振光的作用不同（比旋光度數值相同，方向相反）、對生物體的活性不同。雖然目前尚缺乏阿伐那非對映異構體雜質的毒性和活性試驗研究報道，很多雜質分析試驗也并未將阿伐那非對映異構體列為雜質項進行分析，但是二者在活性、藥理學、藥動學和毒理學方面可能存在差異，臨床一般以單一對映體給藥，因此對阿伐那非對映異構體雜質進行質量控制，可以提高藥品阿伐那非的質量純度和療效。

本文采用手性柱HPLC法檢測阿伐那非對映異構體，結果顯示該方法測定阿伐那非對映異構體精密度、準確度高，在0.10～6.03 μg/mL 質量濃度范圍內線性良好，同時方法檢測限和定量限均能滿足測定要求，表明該方法是一種簡單、快速測定阿伐那非對映異構體的分析方法，適應于阿伐那非異構體的檢測和限度控制。