G1-熵權(quán)法多指標優(yōu)化麻芍平肝顆粒提取工藝

吳錚婷，李潔環(huán)，李智勇，張建軍，陳雪婷，徐文杰，馮健英

［1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東 廣州 510095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095］

麻芍平肝方是廣東省第二中醫(yī)院的臨床經(jīng)驗用方，主要由天麻、鉤藤、白芍、川牛膝、桑寄生、杜仲、茯苓等7 味中藥組成，具有平肝柔肝、補腎安神等功效，用于肝陽上亢所致眩暈、高血壓，療效顯著。目前臨床以湯劑內(nèi)服為主。隨著現(xiàn)代人體質(zhì)的變化及生活節(jié)奏的加快，湯劑難以適應現(xiàn)代人的快捷發(fā)展及要求；且由于患者自煎中藥存在認知差異，煎煮過程中火候、特殊煎煮方法等操作差別，導致湯劑煎煮效果不一，進而影響臨床藥效[1]。因此，本研究擬將其制成顆粒劑，與湯劑相比，既可保持湯劑原有特色及飲片的整體功效，還具有干凈衛(wèi)生、計量準確、免煎易服等優(yōu)點，大大提高患者用藥依從性，同時有益于我國傳統(tǒng)中藥的弘揚與傳承。基于湯劑是中藥顆粒劑的前身，提取工藝是制劑過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對顆粒劑的質(zhì)量產(chǎn)生直接的影響，因此研究麻芍平肝顆粒的提取工藝具有重要意義。

權(quán)重賦予是多指標綜合評分科學合理的直接體現(xiàn)。本研究以天麻素、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)和干膏得率為評價指標，采用G1-熵權(quán)法對各指標進行權(quán)重系數(shù)分配，將主觀與客觀賦權(quán)相結(jié)合，多指標綜合評價考察麻芍平肝方的提取工藝，使優(yōu)化的參數(shù)更合理科學，為其后期研究及生產(chǎn)應用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200（美國安捷倫公司）；HDM-2000B數(shù)顯控溫電熱套（上海比朗儀器有限公司）；DCNSG-30 多功能提取濃縮機組（上海達程實驗設備有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TC-30K 電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)。

1.2 材料

天麻等飲片均購自廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院王洛臨主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2020 年版一部各飲片項下要求；天麻素對照品（批號110807-201306）、芍藥苷對照品（批號110736-201337）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（美國Merck 公司）；液相用水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2-3]

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～12 min，2%A；12～15 min，2%→7%A；15～33 min，7%→30%A；33～40 min，30%→2%A）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：223 nm；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取天麻素對照品、芍藥苷對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含天麻素500 μg、芍藥苷104.4 μg 的對照品儲備液，備用。分別精密量取天麻素對照品儲備液0.1 mL、芍藥苷對照品儲備溶液0.6 mL，置于2 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL 含天麻素25.0 μg、芍藥苷31.3 μg 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按處方比例，稱取飲片210 g，提取3 次，每次加10 倍量水，每次提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮并定容至500 mL。精密量取濃縮液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇適量超聲處理30 min（220 W，50 Hz），放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

分別稱取除天麻、白芍外的飲片，照“2.3”項下方法制備陰性對照溶液，備用。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取上述對照品、供試品及陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：陰性對照溶液色譜中，在與天麻素、芍藥苷相應位置無吸收峰，說明方法專屬性良好。

圖1 麻芍平肝顆粒高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Mashao Pinggan granules

2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取天麻素對照品儲備液0.03、0.05、0.1、0.2、0.25、0.3 mL，芍藥苷對照品儲備液0.2、0.4、0.6、1、1.4、1.7 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含天麻素7.5、12.5、25.0、50.0、62.5、75.0 μg，芍藥苷10.44、20.88、31.32、52.20、73.08、88.74、104.4 μg 的混合對照品溶液。照“2.1”項下色譜條件精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）作圖，得天麻素回歸方程為Y=10.0586X-15.9306，r=0.9999；芍藥苷回歸方程為Y=9.9466X+6.2372，r=0.9999，表明天麻素質(zhì)量濃度在7.5～75 μg/mL、芍藥苷在10.44～104.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 重復性試驗 稱取處方量飲片6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積并計算RSD值，結(jié)果測得天麻素、芍藥苷的RSD值分別為1.82%、1.53%，表明方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 稱取處方量飲片6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12 h 進樣分析，并計算峰面積的RSD 值，結(jié)果測得天麻素、芍藥苷的RSD 值分別為1.95%、1.87%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

2.5.5 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次，測定峰面積并計算RSD 值，結(jié)果測得天麻素、芍藥苷的RSD 值分別為1.13%、1.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的同一供試品溶液9 份，每份0.5 mL，分為低、中、高濃度3組，每組3份。按0.8:1、1:1、1:1.2比例分別加入一定量的對照品，混勻，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，檢測天麻素、芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)，并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，天麻素、芍藥苷的平均加樣回收率分別為100.19%、101.03%（n=9），RSD 值分別為1.07%、1.55%，表明方法符合要求。

2.6 正交試驗設計與結(jié)果

采用正交試驗法，以天麻素質(zhì)量分數(shù)、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)和干膏得率為評價指標，對影響水提取效果的提取次數(shù)（因素A）、加水倍數(shù)（因素B）、誤差（因素C）和提取時間（因素D）3個因素進行考察，以確定最優(yōu)提取工藝條件。正交試驗設計表見表1。

2.6.1 樣品的制備 按處方比例，稱取飲片共9 份，每份210 g，按表1 正交試驗安排進行提取，濾過，合并濾液，并定容至500 mL，備用。

2.6.2 指標成分的測定

2.6.2.1 天麻素、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進樣10 μL測定，分別計算天麻素和芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表1。

2.6.2.2 干膏得率的測定 精密量取各正交試驗樣品溶液50 mL 置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，于105 ℃干燥至恒重，取出至干燥器，放至室溫，精密稱重，計算干膏得率，公式如下：

式中：W為50 mL 濃縮液中干浸膏質(zhì)量；V為定容體積；Wt為飲片質(zhì)量。結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設計表及結(jié)果Table 1 Orthogonal test design table and results

2.7 G1-熵權(quán)法組合賦權(quán)

2.7.1 G1 法賦權(quán) G1 賦權(quán)法是在層次分析法（AHP）基礎上改進的一種主觀賦權(quán)法，其中心思想是對各層指標的重要程度進行對比，避免層次分析法因指標過多而造成工作量大且難以通過一致性檢驗的弊端。通過G1 法反映各指標的重要程度，指標越重要，權(quán)重系數(shù)越大。確定權(quán)重時，首先對評估指標的重要性程度作出判斷，給出指標yk重要性排序[4]；再根據(jù)相對重要程度不同對相鄰指標重要性程度的比值（rk）給予恰當?shù)馁x值[5]；最后依據(jù)相關(guān)公式計算各指標的權(quán)重。rk賦值見表2，主觀權(quán)重系數(shù)Wk計算公式如下：

表2 rk賦值參考表Table 2 rk assignment reference table

式中：k=m,m-1,…,3,2。

綜合考慮麻芍平肝方中君臣佐使、配伍、各成分藥理作用強弱及顆粒劑成型需要，將3 個評價指標關(guān)系設定為：干膏得率（y1）>天麻素質(zhì)量分數(shù)（y2）>芍藥苷質(zhì)量分數(shù)（y3）。并對相鄰2 個指標的重要性之比進行賦值，依次為：r2=1.4，r3=1.2，計算得出干膏得率、天麻素質(zhì)量分數(shù)、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)的主觀權(quán)重系數(shù)分別為0.4330、0.3093、0.2577。

2.7.2 熵權(quán)法賦權(quán) 熵是系統(tǒng)不確定性和無序程度的度量，可用于確定多指標評價系統(tǒng)中各個指標的權(quán)重，將每個評價指標作為1個隨機變量，計算該指標的熵權(quán)系數(shù)，其值變化程度越大，表示越無序且能提供的信息量越大，該指標也就越重要。對于某評價指標，若綜合評分越大，表示該指標處于無序狀態(tài)，在評價中所起的作用越大；反之，則在綜合評價中不起作用[6]。

熵權(quán)法可對實際發(fā)生的數(shù)據(jù)進行整理、計算和分析，得出客觀權(quán)重系數(shù)，精度較高，客觀性強，能夠很好地解釋所得結(jié)果。通過熵權(quán)法確定各個指標權(quán)重，可使提取工藝優(yōu)選的結(jié)果更為合理、可靠、全面。其分析步驟[7-9]如下：①結(jié)合信息熵原理進行指標矩陣構(gòu)建，假設在一個評價體系中，有m個評價對象和n種評價指標，則指標的原始數(shù)據(jù)（干膏得率，天麻素、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)）構(gòu)成n×m階矩陣，為原始矩陣（X）＝(Xij)n×m；②將原始矩陣轉(zhuǎn)換為“概率”矩陣（Pi）；③計算各項指標的信息熵（Hi）；④計算第i項指標的權(quán)重系數(shù)（Wi）；⑤將概率矩陣的數(shù)據(jù)進行加權(quán)處理，得到綜合評價指標（M），Pi、Hi、Wi計算公式如下[10]，結(jié)果見表1。

2.7.3 確定組合權(quán)重 采用乘法合成歸一化法求解綜合權(quán)重，公式如下：

式中：Wj為第j個指標的綜合權(quán)重；W1j為第j個指標的主觀權(quán)重；W2j為第j個指標的客觀權(quán)重；m為評價指標的個數(shù)，計算得干膏得率、天麻素質(zhì)量分數(shù)、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)組合權(quán)重值分別為0.4749、0.1061、0.4190。

2.7.4 計算綜合評分 綜合評分的計算公式如下：

結(jié)果見表1，方差分析見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

方差分析結(jié)果表明，影響該方水提取工藝的因素主次依次為A>B>D，即提取次數(shù)>加水倍量>提取時間，因素A 對試驗結(jié)果有顯著影響，因素B 和D無顯著影響。因此確定提取工藝條件為A3B1D1，即提取3次，每次加10倍量的水，提取1 h。

2.8 驗證試驗

按處方比例稱取飲片3 份，每份210 g，按優(yōu)選的最佳工藝條件提取，并按上述方法測定天麻素質(zhì)量分數(shù)、芍藥苷質(zhì)量分數(shù)及干膏得率，計算綜合評分值，結(jié)果見表4。

表4 最佳提取工藝驗證結(jié)果Table 4 Verification results of optimal extraction process

結(jié)果表明，3 次驗證試驗的綜合評分平均值為99.93，與正交試驗綜合評分最大值差異不大，表明優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

麻芍平肝顆粒主要用于肝陽上亢伴隨頭痛、失眠、高血壓等，其臨床使用效果得到廣泛認可。文獻研究結(jié)果顯示，本處方中與功能主治及現(xiàn)代藥理作用相關(guān)的有效成分主要有苷類化合物、黃酮類化合物、環(huán)烯醚萜等多種活性成分[11-15]，如天麻素、芍藥苷等。此類活性成分主要存在于水提取液中，結(jié)合生產(chǎn)可行性和生產(chǎn)設備條件，確定采用水作為提取溶劑，符合臨床用藥習慣，同時可保持臨床應用中相同的物質(zhì)基礎。

中藥多指標優(yōu)化更能全面、有效、準確地反映提取物質(zhì)量信息，同時也符合中藥多成分、多靶點的特點。本研究根據(jù)君臣佐使、顆粒成型及成分溶出等因素，選取君藥天麻中的天麻素、臣藥白芍中的芍藥苷以及干膏得率為評價指標，對多指標進行權(quán)重系數(shù)的分配，從而優(yōu)化麻芍平肝方的提取工藝參數(shù)。

權(quán)重分配包括主觀賦權(quán)、客觀賦權(quán)和組合賦權(quán)3 類方法[16-18]。單用主觀賦權(quán)易對評價結(jié)果產(chǎn)生人為的主觀選擇、偏好等影響，從而造成決策失誤；另外，單用客觀賦權(quán)亦可能出現(xiàn)主要藥效成分權(quán)重低于次要藥效成分權(quán)重的現(xiàn)象，導致最終藥理效應與臨床適應證不符的結(jié)果。

G1-熵權(quán)法為組合賦權(quán)法，對G1 法主觀賦權(quán)和熵權(quán)法客觀賦權(quán)采取加權(quán)組合，并對組合系數(shù)進行優(yōu)化，可減少主、客觀賦權(quán)的不確定性，使主觀信息和客觀信息都能在指標權(quán)重中充分體現(xiàn)，具有兼顧專家主觀經(jīng)驗和數(shù)據(jù)客觀特性的優(yōu)勢。

綜上所述，本文采用G1-熵權(quán)法結(jié)合正交設計進行多指標優(yōu)化麻芍平肝顆粒的提取工藝參數(shù)，既可避免主觀權(quán)重的隨意性，并且還能兼顧決策人的主觀判斷和待評價對象各指標的內(nèi)在聯(lián)系，提高了工藝參數(shù)的合理性及科學性，能夠有效提供中藥及其制劑提取工藝確證的依據(jù)。