黃芪總黃酮通過調(diào)節(jié)Notch-Wnt 信號通路對強直性脊柱炎模型大鼠炎癥反應(yīng)和成纖維細胞成骨轉(zhuǎn)化的影響

焦士軍，李巖，韋中陽，劉瑞端

（1.安陽市人民醫(yī)院骨外一科，河南 安陽 455000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，廣西 桂林 541001）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，屬于脊柱關(guān)節(jié)病類，主要影響中軸骨骼，特別是骶髂關(guān)節(jié)和脊柱關(guān)節(jié)，其特征為軟骨硬化和骨質(zhì)增生導(dǎo)致的關(guān)節(jié)骨性強直，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)慢性疼痛、活動度降低，伴隨背部疼痛和僵硬，嚴重者甚至出現(xiàn)殘疾，且患虹膜炎、骨質(zhì)疏松和脊柱壓縮性骨折的風(fēng)險大大增加[1]。治療以控制炎癥、減輕癥狀、防止關(guān)節(jié)畸形為目的，包括物理治療、運動鍛煉和藥物治療等，其治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、柳氮磺胺吡啶等[2]，但多具有胃腸道反應(yīng)以及損傷肝、腎功能等副作用，且對骨骼改善作用有限[3]，因此尋找更為安全有效的天然藥物成為當前的研究重點?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪具有多靶點調(diào)節(jié)免疫的作用，被廣泛用于免疫相關(guān)疾病治療[4]。黃芪總黃酮是中藥黃芪的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[5]，Yang等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可通過抑制JNK/AKT/NFκB 信號通路減輕自身免疫性腦脊髓炎小鼠小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥。本研究以AS大鼠為研究對象，探究黃芪總黃酮對其炎癥反應(yīng)和成纖維細胞成骨轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠72 只，6 周齡，體質(zhì)量200～225 g，購于河南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2017-0001。實驗經(jīng)安陽市人民醫(yī)院倫理委員會批準，符合3R原則。

1.2 主要儀器、藥品、試劑

GL-23M 高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；HSA-M1812酶聯(lián)免疫檢測儀（深圳海思安生物技術(shù)有限公司）；DYCZ-24DH 雙板垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；牛軟骨蛋白聚糖、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；黃芪總黃酮（TFA：質(zhì)量分數(shù)95%，成都埃法生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶腸溶片（上海福達制藥有限公司，國藥準字H31020840）；大鼠白細胞介素(Interleukin 6，IL-6)、IL-1β、IL-8 ELISA 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素（bone gla protein, BGP）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide,PINP）檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin抗體（Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 AS模型建立及藥物干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按照潘金洋等[7]的方法復(fù)制AS 大鼠模型。制備免疫刺激制劑：將1 mg/mL 牛蛋白聚糖分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1比例冰上乳化混合。除空白對照組外，其余大鼠均腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏完全佐劑混合液0.2 mL，第14、28 天腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏不完全佐劑混合液0.2 mL，空白對照組同時腹腔注射等體積生理鹽水-弗氏不完全佐劑混合液0.2 mL。

造模22 周，觀察大鼠是否出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限和脊柱僵硬情況，判斷AS 模型是否成功建立后開始藥物干預(yù)，根據(jù)文獻[8]，黃芪總黃酮各劑量組分別給予25、50、100 mg/kg 灌胃，陽性藥物組給予柳氮磺胺吡啶825 mg/kg 灌胃，空白對照組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃，1 次/d，持續(xù)28 d。

末次治療1 h 后，10%（φ）水合氯醛麻醉大鼠，取腹主動脈血5 mL，靜置2 h后離心分離血清，分離大鼠脊柱，切下椎間盤并分離椎間盤上下的軟骨終板，PBS沖洗去除附著表面的血液、組織。脊柱軟骨和血清均保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 ELISA檢測血清、脊柱組織炎癥因子 脊柱軟骨勻漿裂解后，與血清分別按照試劑盒要求加入對應(yīng)試劑、孵育洗板后，酶標儀測定吸光度（A450）。

1.3.3 顯色法檢測ALP、BGP、PINP 含量 按照試劑盒說明書要求提前制備工作液，96 孔板的待測樣本孔中加入5 μL 稀釋后的血清，50 μL 緩沖液和基質(zhì)液，37 ℃水浴15 min，加入150 μL 顯色劑，混勻后酶標儀測定A520。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達 脊柱軟骨勻漿裂解后，水浴變性，蛋白定量后上樣電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)模、顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶圖片，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均設(shè)置3 個復(fù)孔，采用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪總黃酮對AS模型大鼠炎癥反應(yīng)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清、脊柱組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組血清、脊柱組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著降低（P<0.05）。見表1、2。

表1 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-8 水平變化的影響Table 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levelsof serum IL-6,IL-1β and IL-8 in AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

表1 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-8 水平變化的影響Table 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levelsof serum IL-6,IL-1β and IL-8 in AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

與空白對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組IL-669.70±11.41160.09±18.32*144.22±18.16101.04±16.42#91.07±12.70#77.72±13.38#IL-1β 90.70±21.53200.97±24.23*182.44±31.68142.03±33.16#121.26±23.33#106.93±21.87#IL-863.32±14.31163.24±29.83*145.19±19.31110.43±14.70#88.30±16.29#82.48±13.67#

2.2 黃芪總黃酮對AS模型大鼠ALP、BGP、PINP影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清ALP 活性、BGP 含量升高（P<0.05），PINP 含量降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組血清ALP 活性、BGP 含量降低（P<0.05），PINP含量升高（P<0.05）。見表3。

表2 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠脊柱組織IL-6、IL-1β、IL-8水平變化的影響Table 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of IL-6,IL-1β and IL-8 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

表2 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠脊柱組織IL-6、IL-1β、IL-8水平變化的影響Table 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of IL-6,IL-1β and IL-8 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

與空白對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組IL-660.11±17.55127.98±22.58*111.69±23.8991.47±20.25#80.52±17.02#79.04±16.69#IL-1β 74.26±6.74149.52±9.56*137.53±14.59113.07±11.36#103.32±13.44#92.36±12.81#IL-8183.56±23.67328.77±21.52*294.35±28.33255.10±21.50#225.12±24.06#224.69±17.49#

表3 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠血清ALP、BGP、PINP 變化的影響Table 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of serum ALP,BGP and PINP in AS rats (±s,n=12)

表3 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠血清ALP、BGP、PINP 變化的影響Table 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of serum ALP,BGP and PINP in AS rats (±s,n=12)

與空白對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組ρ(ALP)/（U·L-1）12.69±2.0424.11±3.26*22.73±0.9819.07±1.37#16.68±1.81#15.95±1.04#ρ(BGP)/（mg·L-1）1.11±0.211.84±0.25*1.67±0.261.54±0.24#1.44±0.22#1.40±0.22#ρ(PINP)/（ng·mL-1）47.41±4.0125.38±1.97*28.29±2.3034.70±2.39#40.52±3.12#42.73±2.83#

2.3 黃芪總黃酮對AS 模型大鼠成纖維細胞成骨轉(zhuǎn)化的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠脊柱組織中BMP-2、TGF-β1 蛋白表達水平降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組脊柱組織中BMP-2、TGF-β1 蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 黃芪總黃酮對AS模型大鼠脊柱組織BMP-2、TGF-β1蛋白表達水平變化的影響Figure 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of BMP-2 and TGF-β1 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

2.4 黃芪總黃酮對Notch-Wnt信號通路影響

與空白對照組比較，模型組大鼠脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表達水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、βcatenin蛋白表達水平均降低（P<0.05）。見圖2、3。

圖2 黃芪總黃酮對AS模型大鼠脊柱組織Notch信號通路蛋白表達水平變化的影響Figure 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Notch signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

圖3 黃芪總黃酮對AS模型大鼠脊柱組織Wnt信號通路蛋白表達水平變化的影響Figure 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Wnt signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

3 討論

關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)是AS 的主要特征，IL-1α、IL-1β基因位點的多態(tài)性與AS 易感性相關(guān)，NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β在AS中呈高表達[9-10]。血清IL-6、IL-8水平可作為AS輔助診斷和疾病活動度評價的重要指標[11]。黃芪是臨床常用中藥，具有補氣固表、托毒排膿等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪總黃酮等主要活性成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[12]。馬歷歷等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可減輕腦缺血再灌注造成的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡。研究表明黃芪總黃酮通過調(diào)控NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎和免疫作用[14]。本研究中，經(jīng)黃芪總黃酮干預(yù)的AS 大鼠血清和脊椎組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著降低，這與萬寶年等[15]的研究結(jié)果類似，表明黃芪總黃酮可減輕AS大鼠炎癥反應(yīng)。

脊柱和周圍關(guān)節(jié)的異位骨化也是AS 的重要疾病過程，在AS 晚期，軟骨逐漸被骨骼取代，出現(xiàn)關(guān)節(jié)強直，最終導(dǎo)致殘疾。成纖維細胞是結(jié)締組織的主要細胞類型之一，能產(chǎn)生富含膠原的細胞外基質(zhì)，在特定條件下可分化為成骨細胞，參與AS 異位骨化，多種骨生長因子參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和骨代謝[16]。成骨細胞特異性分泌蛋白和細胞外基質(zhì)礦化能力可準確反映成骨分化程度，ALP 是一種與骨礦物質(zhì)形成相關(guān)的成骨細胞分化標志物，BGP 主要由成骨細胞合成，PINP 是反映骨代謝的指標，在骨形成時釋放[17-18]。成纖維細胞在特定的細胞因子刺激下才能轉(zhuǎn)化為成骨細胞，BMP-2 是活性最高的骨形態(tài)發(fā)生蛋白，通常與TGF-β超家族一同誘導(dǎo)成骨分化。本研究中，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組大鼠血清ALP 活性降低，BGP 含量降低，PINP 含量升高，脊柱組織中BMP-2 和TGF-β1 蛋白表達均升高，這與葉松慶等[19]的研究結(jié)果一致，表明黃芪總黃酮可調(diào)控AS大鼠成纖維細胞成骨轉(zhuǎn)化。

Notch 信號通路在骨骼發(fā)育和代謝中起關(guān)鍵作用，也會影響骨折后骨重塑和再生過程。Notch 受體和配體在各種骨細胞中存在差異表達，功能也不相同，Notch1 通過抑制Runx2 抑制成骨細胞分化，Notch2 可刺激破骨細胞生成[20]。在AS 發(fā)生發(fā)展過程中，Notch 信號通路可與其他信號通路共同被激活，骨細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的激活會增加骨形成、骨礦物質(zhì)密度和松質(zhì)骨體積，β-catenin通過Notch 配體Jagged1 與Notch 鏈接，也有研究表明Notch 胞內(nèi)段穩(wěn)定了胞質(zhì)內(nèi)β-catenin，從而延長了Wnt 信號[21-22]。本研究中，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組大鼠脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表達水平均降低，這與任磊等[23]的研究結(jié)果類似，表明黃芪總黃酮可通過抑制Notch-Wnt信號通路改善AS。

綜上所述，中、高劑量黃芪總黃酮可改善AS 大鼠炎癥反應(yīng)和成纖維細胞成骨轉(zhuǎn)化，這可能與其能抑制Notch-Wnt信號通路相關(guān)。