感染期血清外泌體在伯氏瘧原蟲紅內期肝損傷中的作用

黃麗，張鑫，黎廣智，王永飛，李小波，金小寶，黃博，3*

（1.廣東藥科大學廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006）

瘧疾是全球三大傳染病之一，廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣等地區，其嚴重影響流行區人口的健康和生命，并長期制約當地社會經濟發展。據WHO《World Malaria Report 2021》，2020 年全球瘧疾發病人數估計2.41 億，死亡人數估計62.7萬［1］。瘧疾的臨床癥狀復雜多變，輕者出現發燒、出汗和寒冷等，重者出現急性腎損傷、肺水腫、黃疸、貧血、甚至死亡［2］。肝臟參與瘧疾感染進程，一方面作為紅外期肝細胞內裂體增殖所必需的器官，另一方面作為紅內期肝臟中的紅細胞內裂體增殖所致宿主致病和死亡的主要參與器官［3］。瘧疾感染導致的肝損傷是一種發生率較高、但尚未受到足夠重視的并發癥［4］。臨床研究發現，瘧疾患者的肝臟出現不同程度的損傷（包括肝腫大、黃疸、轉氨酶升高和門脈內炎性細胞浸潤等）、甚至肝功能衰竭和肝細胞壞死等［4-5］。動物實驗發現，感染鼠源性瘧原蟲（P. bergheiANKA）的小鼠肝臟出現充血、瘧色素沉積、肝細胞空泡樣變性和萎縮以及微血管堵塞等［6］。盡管已有研究提示瘧疾肝損傷與高蟲荷、氧化應激、瘧色素沉積、炎癥細胞浸潤和免疫細胞功能異常相關［5］，然而其損傷機制尚未完全闡明。瘧原蟲具有復雜的生活史和多種免疫逃避策略等獨特的生物學特征，深入研究瘧原蟲-宿主間的相互作用將有助于闡明瘧疾肝損傷的致病機理，為探索新的治療方案或研發有效的瘧疾疫苗提供新方向。

外泌體（exosome）是一種細胞分泌到胞外的、直徑為30～100 nm 的多囊泡體，其攜帶lncRNAs、microRNAs、蛋白質和脂質等多種成分，介導細胞間短/長距離的通訊并調控細胞功能［7］。越來越多的研究發現，包括瘧原蟲、陰道毛滴蟲、弓形蟲和錐蟲等多種寄生蟲均可分泌外泌體［8］。寄生蟲源性外泌體具有傳遞毒力因子、抗藥基因和分化因子功能，在寄生蟲的繁殖和致病，調控宿主免疫應答等方面發揮重要作用，從而實現寄生蟲-寄生蟲間和寄生蟲-宿主之間的相互作用等［8］。已有研究表明，惡性瘧原蟲（P.falciparum）感染人體后，感染瘧原蟲紅細胞（infectedred blood cells，iRBC）分泌的外泌體數量明顯增加，且與患者的病理損傷程度呈正相關［9］，提示瘧原蟲源性外泌體可能參與瘧原蟲侵襲和瘧疾發病過程。然而，Martin-Jaular 等［10］發現感染約氏瘧原蟲（P. yoelii17X）小鼠血漿外泌體可以誘導小鼠機體產生高水平的IgG2a和IgG2b，進而增強小鼠抵抗P.yoelli17X感染能力。可見，瘧原蟲源性外泌體在瘧原蟲-宿主間的相互作用中的生物學功能復雜，其在紅內期肝損傷中作用的報道較少。因此，本文利用P.bergheiANKA 感染昆明小鼠模型，研究感染P. bergheiANKA 小鼠血清外泌體對紅內期肝組織病理損傷的調節作用，并探討分析其潛在的致病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和蟲株

雌性昆明小鼠，6 周齡，體質量約20 g，由廣東省實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（粵）2021-0093。小鼠飼養于廣東藥科大學實驗動物中心，采用SPF 級小鼠標準飼料和高壓滅菌水喂養。P. bergheiANKA 株由廣州中醫藥大學科技產業園有限公司惠贈，并于液氮中冷凍長期保存。

1.2 感染期血清外泌體的提取和鑒定

共計12 只雌性昆明小鼠經腹腔注射1.0×106個P.bergheiANKA 寄生紅細胞（iRBC）/只。當紅細胞原蟲感染率達約40%時，乙醚麻醉小鼠，眼球取全血，1000 r/min離心3 min收集血清。按照血清型總外泌體分離試劑盒說明書（No. 4478360#, Invitro‐gen）富集感染小鼠的血清外泌體。具體步驟如下：血清經3000 r/min 離心30 min，棄沉淀。將5 mL 外泌體分離試劑加入10 mL 上清液，12000 r/min 離心30 min，收集外泌體沉淀，并加入PBS（50 μL）重懸沉淀。TEM 負染色觀察外泌體的形態：將5 μL分離后的感染小鼠血清外泌體重懸于PBS（40 μL）中，渦旋均勻。取10 μL 重懸液滴加銅網上室溫沉淀5 min，接著滴加10 μL 乙酸雙氧鈾溶液銅網上染色2 min，FEI Tecnai G2 Sprit Twin TEM（FEI, USA）觀察。Western blot 檢測感染期血清外泌體表面的CD9 和CD63 表達：BCA 法測定外泌體或感染紅細胞裂解物的蛋白濃度，50 μg 蛋白（外泌體或感染紅細胞裂解物）依次進行SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗（anti-mouse CD9，稀釋倍數1∶1000；antimouse CD63，稀釋倍數1∶1000；BD Biosciences,USA）4 ℃孵育過夜、二抗（anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase，稀釋倍數1∶5000；Jackson Immunoresearch Labs Inc., USA）室溫孵育1 h、ECL A/B 混合液顯色、曝光、凝膠圖像保存，應用Alpha 軟件分析目標蛋白的灰度值。以β-actin蛋白為內參照。

1.3 實驗分組

將48 只雌性昆明小鼠隨機分為4 組：正常對照組（即Control 組，8 只）、外泌體組（即Exos 組，8 只，每天每只鼠經尾靜脈注射50 μg 外泌體）、感染組（即Pb組，16 只，每只鼠經腹腔注射106個iRBC）和感染+外泌體組（即Pb+Exos 組，16 只，每只鼠腹腔感染106個iRBC，且感染后每天每只鼠經尾靜脈注射50 μg 外泌體）。當小鼠呈現共濟失調、癱瘓、抽搐、昏迷等神經系統功能障礙的癥狀時，且在24 h內死亡，即可判斷為腦型瘧模型小鼠。記錄各組小鼠的腦型瘧發生率和生存時間。薄血膜吉姆薩染色法計數紅細胞原蟲感染率：取尾靜脈血制備薄血膜片，經甲醇固定，吉姆薩染色，流水沖洗和自然晾干，在光學顯微鏡（×1000）下血球計數儀檢測紅細胞原蟲感染率。紅細胞原蟲感染率=100%×iRBC數/紅細胞總數。

1.4 H&E染色觀察肝臟病理變化

于感染后第9 天，取各組小鼠肝組織，10%（φ）中性多聚甲醛溶液中固定48 h，經梯度乙醇脫水、常規石蠟包埋后，切成5 μm 厚度的切片。經蘇木素-伊紅（H&E）染色后光學顯微鏡下(Leica, Germany)觀察肝組織病理學變化情況（×100），并計算肝組織的炎癥點密度（即炎癥點/視野）。

1.5 免疫組化染色與觀察肝組織M1 型巨噬細胞標識物iNOS表達

感染后第9 天的肝組織切片依次經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖溶液微波爐加熱修復抗原，3.0%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉，一抗[兔源iNOS 抗體（Affinity，稀釋比1∶200）]4°C孵育過夜，二抗[山羊抗兔IgG（H+L）HRP（Affinity，稀釋比1∶200）]室溫孵育50 min，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，置于普通光學顯微鏡下（×400）觀察拍照，計算iNOS 染色陽性細胞數目。

1.6 qPCR 檢測肝組織促炎癥/抑炎癥細胞因子的mRNA表達量

取各組感染后第9天的肝組織約100 mg置于1 mL Trizol 液中，按照試劑盒說明書提取組織總RNA（No. 9109#, TaKaRa）。按 照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書（No.6210B#,TaKaRa）將1 μg RNA 逆轉錄為cDNA，使用SYBR?Premix Ex Taq TM（2×）試劑盒方法在CFX96 Touch實時熒光定量PCR系統（BIO-RAD,USA）中測定肝組織促炎癥/抑炎癥細胞因子的mRNA表達量。qPCR反應體系：1.0 μL的模板cDNA，5.0 μL2×SYBR PremixExTaq，0.5μL上引物，0.5 μL下引物，并加滅菌蒸餾水至10 μL。qPCR 反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸5 s，43 個循環；70 ℃延伸10 min。促炎癥/抑炎癥細胞因子和內參β-actin 的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算細胞因子的mRNA相對表達量。

表1 qPCR反應的基因及其引物序列Table 1 Primer sequences of target genes used for qPCR assays

1.7 統計學分析

應用GraphPad Prism 5 軟件對數據進行統計學分析，實驗數據以表示。兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗，多組間比較應用one-way ANOVA 檢驗。采用Log-Rank test 和a time-series analysis test法分別分析兩組間生存時間（即半數生存期）和每天紅細胞原蟲感染率。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 感染期血清外泌體的提取和鑒定

TEM 結果顯示（圖1A）：感染期血清外泌體呈典型的“杯盤”形態特征，其顆粒直徑為30～150 nm，與經典外泌體結構高度一致；Western blot檢測到感染期血清外泌體的CD9和CD63表達呈陽性，而感染紅細胞裂解物罕見或未見CD9和CD63表達（圖1B）。上述結果表明：利用血清型總外泌體分離試劑法成功富集感染期血清外泌體。

圖1 感染期血清外泌體的鑒定Figure 1 Characterization of serum-derived exosomes from infected mice

2.2 感染期血清外泌體對感染小鼠生存時間、腦型瘧發生率和紅細胞原蟲感染率的影響

Control組和Exos組小鼠正常存活，且未見任何異常癥狀和原蟲血癥。然而，Pb組小鼠在感染后第7 天出現死亡，第22 天全部死亡。感染+外泌體組（Pb+Exos）小鼠在第7 天出現死亡，第18 天小鼠全部死亡（圖2A）。Pb組和Pb+Exos 組均發生腦型瘧模型小鼠，且小鼠出現腦型瘧癥狀時間均為感染后第7～9 天。與Pb組相比，Pb+Exos 組小鼠的腦型瘧發生率顯著上調（27%vs48%，P=0.002，圖2B），而半數生存期顯著下調（17.5 dvs11.5 d，P=0.005，圖2A）。薄血膜吉姆薩染色顯示：與Pb組相比，Pb+Exos 組小鼠紅細胞原蟲感染率在感染后第3～18 天差異均無統計學意義（圖2C）。

圖2 感染期血清外泌體對感染小鼠的生存時間（A）、腦型瘧發生率（B）和紅細胞原蟲感染率（C）的影響Figure 2 Effect of serum-derived exosomes from infected mice on the survival time (A), cerebral malaria incidence (B), and para‐sitemia(C)in P.berghei ANKA-infected mice

2.3 感染期血清外泌體對小鼠肝組織病理變化的影響

H&E 染色顯示（圖3）：Control組和Exos組小鼠肝組織結構清晰、正常，肝細胞形態結構完整，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀分布，罕見或未見炎性細胞浸潤。然而，Pb組小鼠肝臟結構紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤和未被降解的瘧色素。與Pb組相比，Pb+Exos組小鼠的肝臟壞死區域顯著增加，伴隨顯著增多的炎性細胞聚集和浸潤（～12 個炎癥點/視野vs～30 個炎癥點/視野，P=0.002），差異有統計學意義。

圖3 感染期血清外泌體對感染小鼠肝組織病理損傷的影響Figure 3 Effect of serum-derived exosomes from infected mice on histopathological change of liver tissues in P. berghei ANKAinfected mice(HE,100×)

2.4 感染期血清外泌體對小鼠肝組織M1 巨噬細胞極化的影響

免疫組化結果顯示（圖4）：Control 組或Exos 組的小鼠肝組織罕見或未見M1 型巨噬細胞標記物iNOS 表達。Pb組小鼠肝組織的iNOS 表達呈現陽性，且與Control 組相比顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01）；此外，Pb+Exos 組肝組織M1 型巨噬細胞極化標記物iNOS的表達水平與Pb組相比顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。上述結果表明感染期血清外泌體可促進感染小鼠肝組織的巨噬細胞增殖和M1極化。

圖4 感染期血清外泌體對感染小鼠肝組織M1型巨噬細胞標識物iNOS表達的影響（免疫組化，400×）Figure 4 Effect of serum-derived exosomes from infected mice on the expression of iNOS in liver tissues of P. berghei ANKAinfected mice

2.5 感染期血清外泌體對小鼠肝組織促炎癥/抑炎癥細胞因子表達水平的影響

qPCR 檢測顯示（圖5）：Exos組小鼠肝組織的促炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和抑炎癥細胞因子（IL-4 和IL-10）的mRNA 表達水平與Control組相比差異均無統計學意義（P>0.05）。與Control 組相比，Pb組小鼠肝組織TNF-α（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、IL-6（P=0.003）、IL-4（P<0.001）和IL-10（P<0.001）等基因mRNA 表達水平均顯著上調。此外，與Pb組相比，Pb+Exos 組小鼠肝組織TNF-α（P=0.003）、IL-1β（P=0.035）和IL-6（P=0.006）的mNRA表達水平顯著上調，而IL-4（P=0.010）和IL-10（P=0.007）表達水平顯著下調。

圖5 感染期血清外泌體對感染小鼠肝組織促炎癥/抑炎癥細胞因子mRNA表達水平的影響Figure 5 Effect of serum-derived exosomes from infected mice on the expression of pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokine mRNA in liver tissues of P.berghei ANKA-infected mice

3 討論

瘧疾肝損傷是一種發生率較高、但尚未受到足夠重視的并發癥，且其損傷機制尚未完全闡明。作為固有免疫細胞的重要組成部分，肝組織中的巨噬細胞嚴格調控瘧原蟲的感染進程，一方面非特異性吞噬、清除感染瘧原蟲的紅細胞和抑制瘧原蟲釋放到血液，另一方面因其異常激活誘導過度的炎癥反應加重紅內期肝組織的病理損傷[11]。已有研究表明肝組織中的CD68+陽性巨噬細胞可作為子孢子突破竇周屏障實現侵襲肝臟的主要載體之一[12]。越來越多的研究證實巨噬細胞分化為M1 型（促炎癥作用）和M2 型（抑炎癥及促修復作用），而一旦巨噬細胞M1/M2 型極化失衡，將導致多種疾病的發生、發展和轉歸[13-14]。感染P.bergheiANKA的小鼠小腸組織的CD68+陽性巨噬細胞的數量明顯升高，而巨噬細胞M1 型極化則加重感染小鼠的小腸組織病理損傷[15]。然而，關于巨噬細胞M1 型極化在瘧原蟲紅內期肝組織病理損害作用及其調控因素的相關報道較少見。

盡管Martin-Jaular 等[10]發現感染P. yoelii17X小鼠血漿外泌體誘導BALB/c 小鼠機體產生較高水平的IgG2a 和IgG2b，發揮增強BALB/c 小鼠抵抗P.yoelli17XL 感染的作用。然而，本研究結果顯示尾靜脈注射感染期血清外泌體后，感染P. bergheiANKA 昆明小鼠的存活時間顯著縮短、腦型瘧發生率顯著升高，以及肝組織的病理損傷明顯加重?？梢?，瘧原蟲源性外泌體的生物學功能復雜，其損傷或保護宿主作用可能與瘧原蟲蟲種、宿主遺傳背景和外泌體來源有關。已有研究證實激活的M1 型巨噬細胞產生大量TNF-α、IL-1β和IL-6 等促炎癥因子，而激活M2 型巨噬細胞后可釋放大量的IL-4 和IL-10 等抑炎癥因子[16]。進一步的研究表明TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎癥因子，盡管在瘧疾感染早期扮演促進殺死瘧原蟲的關鍵作用，但其過度活化則導致瘧疾的病理損傷[17-18]。此外，IL4 和IL-10 被認為是一類可抵抗由Th1細胞因子驅動的致命瘧疾損傷反應的抗炎癥因子[19]。本研究結果顯示，感染期血清外泌體可上調肝組織M1 型巨噬細胞數量和促炎癥因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA 表達水平，下調抑炎癥因子（IL-4 和IL-10）mRNA 表達水平。同時，既往研究表明受腦型瘧模型小鼠血漿外泌體刺激后，巨噬細胞分泌更多的TNF-α 及促進其受體超家族蛋白CD40 的表達[20]。此外，人源性瘧原蟲蟲株（包括P.falciparum、P.vivax和P.malariae等）感染紅細胞釋放的外泌體或類似物與未感染紅細胞相比提高10倍多，且其刺激外周血單核細胞和巨噬細胞釋放促炎癥因子，呈現出強烈的促炎癥反應[21]。Barker 等[22]發現腦型瘧模型小鼠（即C57BL/6 小鼠感染P.bergheiANKA）血漿外泌體的miR-155表達量較非腦型瘧模型小鼠（即BALB/c小鼠感染P.bergheiANKA）顯著升高。此外，Cohen 等[23]和Opadokun等[24]發現腦型瘧模型小鼠（即CBA 小鼠感染P.bergheiANKA）血漿外泌體的miR-146a表達量較非腦型瘧模型小鼠（即CBA 小鼠感染P. yoelii）顯著上調。進一步研究發現miR-155 或miR-146a可分別誘導巨噬細胞M1 極化和M2 極化[25]。本研究結果提示，感染期血清外泌體誘導P. bergheiANKA 感染小鼠肝組織出現強烈的促炎癥反應和加重紅內期肝組織病理損傷，其原因可能與外泌體經miR-155 或miR-146a 分別促進巨噬細胞M1 極化或抑制巨噬細胞M2 極化有關。然而，感染期血清外泌體靶向調控M1 極化的作用機制有待深入研究。本研究存在一些不足之處：（1）本文缺乏正常小鼠血清外泌體對照組，以及未分離iRBC 源性外泌體；（2）本文未深入研究感染血清外泌體靶向調控巨噬細胞M1 極化的作用機制。因此，本課題組將在后期研究中檢測正常小鼠血清外泌體與感染期血清外泌體的microRNAs 和蛋白表達的差異，探討外泌體靶向調控巨噬細胞M1極化的作用機制。

綜上所述，本文利用感染期血清外泌體初步探討了瘧原蟲-宿主間的相互作用，研究結果提示感染期血清外泌體加重紅內期肝臟病理損傷，其原因可能與促進肝臟組織巨噬細胞增殖和M1 極化有關，但其詳細機制有待闡明。本研究結果可能為后續以感染期血清外泌體為靶點的瘧疾肝損傷治療提供了新思路。