海水入侵區含水層中原核微生物多樣性和群落結構特征及其意義

桑石磊，黃柏強，王永智，劉華雪，許莉佳，張 晉

1. 生態環境部華南環境科學研究所，廣東 廣州 510535

2. 河海大學長江保護與綠色發展研究院，水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098

3. 中國科學院新疆生態與地理研究所，新疆 烏魯木齊 830011

地下水是一種寶貴的飲用水資源，為我國近70%的人口提供飲用，95%以上的農村人口主要飲用地下水，40%的農田主要用地下水來灌溉[1]. 改革開放40 多年來，社會經濟的快速發展和各種污染物的排放引起了地下淡水資源的缺乏[2]. 海水入侵再加上地下水需求的激增以及全球氣候變化、海平面上升等自然因素，進一步加劇了地下淡水資源的短缺[3].特別是許多沿海地下含水層正面臨著人為污染[4]、地下鹵水[5]或過量抽取地下水[6]所導致的海水入侵作用等因素，嚴重威脅著地下水的安全. 雖然地下含水層大多是寡營養的，但微生物幾乎是地下水環境中唯一的棲息者[7]. 研究表明，含水層是受微生物群落活動影響的特殊的生態系統[8]，與營養物質運移、元素的生物地球化學循環和污染物降解作用密切相關[9].

研究[10-12]表明，微生物群落是地下水生態系統的重要組成部分. 近年來，多種微生物參數，包括微生物群落、多樣性與理化特性的相互作用等，已被用來作為水質評價的指標. 例如，為了尋找監測地下水水質的生物參數，Unno 等[13]分析了微生物類群與水文化學之間的關系，發現微生物組分析是監測地下水健康的有效工具. Ye 等[14]比較了海底地下水不同采樣位置的微生物指紋圖譜，并選擇了一些潛在的細菌類群(如共生單胞菌等)進行生物修復. 為有效了解和保護淡水地下水，研究地下含水層微生物群落的組成和功能是十分必要的. 然而，在海水入侵地區，地下水中微生物群落的多樣性和結構組成還未得到深入刻畫，且其群落結構與水文環境的相互作用關系仍不明確.

珠江三角洲地區供應將近5 000 萬人口的用水需求，但幾乎一半的含水層中地下水含鹽度超過1 g/L[15-16]. 盡管水資源豐富，但由于土壤和水污染[17]以及珠江口嚴重的咸水入侵問題[18]，導致珠江三角洲一些地區地下水中總溶解固體含量甚至超過10 g/L[19]. 研究表明，地下水鹽度的來源是由全新世海侵作用遺留的古海水[20-21]. 為了提高對地下水的管理水平，學者對珠江三角洲含水層水文地球化學特征進行了大量研究[21-22]，但對該地區地下水鹽度梯度下微生物群落結構的研究較少. 事實上，在世界上大多數國家的水質監測中，對地下生態系統中微生物群落的研究一直都未得到充分重視[23]. 研究[24]表明，微生物是地下水生態系統的重要組成部分，是評價地下水水質不可缺少的參數. 為有效地了解和保護地下淡水，對含水層微生物群落的組成和功能進行調查研究很有必要.

對地下水微生物多樣性的研究技術包括常規的培養技術和基于DNA 的分子生物學研究方法[25]. 由于環境生態系統中絕大多數微生物無法在人工培養基中輕易培養，而基于DNA 的高通量測序方法在探索復雜環境中的微生物群落方面具有更強的優勢. 為研究珠江三角洲地下水中微生物群落的多樣性和分類組成，采用下一代測序(next generation sequencing,NGS)技術，從水文生態學的角度描述微生物群落結構與環境變量之間的關系；通過對珠江三角洲地下水水質空間變化和微生物群落結構的研究，分析地下水微生物群落對鹽度變化的響應，以期為地下咸水中微生物群落結構及其環境相互作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 采樣地點、樣品采集

珠江三角洲屬亞熱帶季風氣候，氣候溫暖濕潤，年均氣溫22 °C 左右，年均降水量1 600～2 000 mm，主要集中在4—10 月. 2017 年5 月，在廣州市中部和南部地區選擇22 個監測井，包括5 個重度咸水監測井(S)(TDS 濃度＞10 g/L，TDS 表示溶解性總固體)、5個中度咸水監測井(M1)(3 g/L＜TDS 濃度＜10 g/L)、3個微咸水監測井(M2)(1 g/L＜TDS 濃度＜3 g/L)和9 個淡水監測井(TDS 濃度＜1 g/L).

為保證取得的地下水樣可以表征含水層中地下水的性質，采樣之前均對監測井進行洗井工作，采用專業的地下水抽水泵并以小流量抽水洗井. 根據監測井井管尺寸等信息計算管內水體積，保證洗井過程抽水量大于管內水體積的3 倍，以除去殘留在監測井中的“死水”，待水體各項理化指標(溫度、鹽度和pH)穩定后再采集樣品. 現場測試的理化指標主要包括溫度(temperature,T)、pH、電導率(electrical conductivity,EC)、溶解性總固體(total dissolved solids, TDS)、溶解氧 (dissolved oxygen, DO)和氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)，測量儀器為電導率儀(Orion 320C-01A, Thermo Scientific, USA). 地下水樣本都收集在無菌的10 L 塑料容器中，用于過濾收集微生物樣本，通過抽濾法在0.22 μm 的纖維濾膜上富集微生物，將濾膜保存于無菌離心管，封口膜密封后即刻存放在—80 ℃冰箱中備用；每個樣本再過濾500 mL，一式三份，用于理化分析. 所有樣品在運輸過程中均保存在4 ℃的冰柜中，運送回實驗室立即處理.

1.2 理化性質分析

理化分析參考Greenberg 等[26]的方法，為了減少水樣雜質的干擾，在測試前，將水樣用0.45 μm 的濾膜過濾. 陽離子(K+、Ca2+、Na+和Mg2+)濃度采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICAP 7600 ICP-OES,Thermo Scientific, USA)測試，陰離子(NO3—、Cl—和SO42—)濃度使用離子色譜儀(883 chromatograph,Metrohm, Switzerland)測定. HCO3—和CO32—濃度采用化學滴定法(DZ/T 0064.49—1993《地下水質檢測方法》)檢測.

1.3 DNA 提取和PCR 擴增及測序

將水樣按照試劑盒MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit (Qiagen/MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad,CA, USA)操作步驟進行DNA 提取. 用1%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA 的提取效果，用NanoDrop 2000(Isogen Life Science, the Netherlands)光度儀檢測DNA的純度和濃度. 利用原核微生物16S rRNA V4 區引物515FmodF(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806RmodR (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行目標基因的PCR 擴增[27]. 擴增程序：95 ℃預變性3 min，27 個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃下保存(PCR 儀，ABI GeneAmp? 9700 型). PCR 反應體系：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(5 μmol/L ) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 補足至20 μL. 每個樣本設3個重復. 按照NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)標準流程建庫操作，將樣品送到上海美吉生物科技有限公司，采用Illumina HiSeq 2500 PE250 測序平臺進行擴增子文庫的測序.

利用Trimmomatic 軟件(V0.33)對測序數據過濾后，通過FLASH(V1.2.11)軟件對數據進行拼接，再利用Mothur 軟件對拼接后的序列進行質量控制及過濾[28]，得到有效的拼接片段. 過濾reads 尾部質量值在20 以下的堿基，設置50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp 以下的reads，去除含N 堿基的reads；根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對reads 拼接(merge)成一條序列，最小overlap 長度為10 bp；拼接序列的overlap 區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據序列首尾兩端的barcode 和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode 允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2.

采用 RDP Classifier algorithm 方法和 Silva 16S rRNA 數據庫對物種進行注釋分類(設置閾值為70%)，將相似度高于97%的定義為一個OTU(operational taxonomic unit，OTU). α-多樣性計算：包括群落的多樣性指數(Shannon-Wiener)、豐富度指數(Chao1)、均勻度指數(Heip)和序列的覆蓋度(Good's coverage)，使用Mothur 軟件完成計算[28]. β-多樣性的計算：比較樣本之間的相似性，在OTU 水平上利用Bray-Curtis 算法做PCoA 分析，用R 語言進行統計分析和制圖[29]. 通過Cytoscape v2.8.3 對不同樣本間的物種豐度信息進行共現性網絡分析[30]，相關性熱圖用R 語言制圖[29]，采用VIF(Variance inflation factor，VIF)分析去掉共線性環境因子，并進一步使用Canoco 4.5 軟件進行典范對應分析(CCA). 該文涉及的所有原始序列已上傳至NCBI 數據庫，其登錄號為SRP118856.

2 結果與分析

2.1 微生物群落的豐富度和多樣性

該研究中，從22 個地下水樣品中共獲得814 701條基因序列，對所有樣品進行抽平，共獲得1 427 個OTUs (97%的置信度)，OTUs 的數目為415～804 個，表明觀測到的微生物豐度在不同水體中存在差異. 微生物群落的Chao1 豐富度指數為650～1 047，Shannon-Wiener 多樣性指數為0.32～0.60. 一般來說，重度咸水監測井(S)樣品包含的微生物群落的豐富度和均勻度指數高于淡水監測井(F)樣品. 然而，微生物群落的豐富度和均勻度指數的最低值出現在微咸水(M2)樣品中.

Shannon-Wiener 多樣性指數表明，含水層中微生物群落多樣性隨鹽度梯度發生顯著變化. 然而，微生物群落多樣性指數最高值出現在重度咸水(S)樣品中，而最低值出現在微咸水(M2)樣品中，多樣性指數的變化并不完全與鹽度梯度一致. 微生物序列的覆蓋度都在99%以上，表現出了較好的序列完整性.

2.2 微生物群落的組成

經過數據庫的比對，該研究中基因序列可以分為細菌和古菌兩大類，大多數的序列鑒定為細菌(見圖1). 具體來說，共分屬于47 個原核微生物門類，大多數序列從屬于變形菌門(Proteobacteria, 占比為50%～94%)、厚壁菌門(Firmicutes, 占比為3%～45%)、奇古菌門(Thaumarchaeota, 占比為0～29%)、放線菌門(Actinobacteria, 占 比 為 0～14%)、 廣 古 菌 門(Euryarchaeota, 占 比 為 0～13%)和 擬 桿 菌 門(Bacteroidetes, 占比為0～10%)，還有一些序列占比在1%～10%之 間， 包 括 Acidobacteria、 Chloroflexi、Gemmatimonadetes 和Ignavibacteriae. 從結果來看，古菌在咸水中占比更高，廣古菌群(Euryarchaeota)在重度咸水(S)樣品中占比更高，而奇古菌門(Thaumarchaeota)在高濃度咸水樣品中占比更高.

圖 1 微生物群落在門水平上的分布Fig.1 Microbial composition analysis based on taxonomic classification at the phylum level

占比最高的變形菌門在綱水平上主要為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，在重度咸水(S)、中度咸水(M1)、微咸水(M2)和淡水(F)監測井樣品中分別為45%、30%、46%和38% (見圖1). 淡水微生物群落中β-變形菌綱在總序列中的占比高達34%，而在重度咸水樣品中其占比不超過2%. 與其他樣品相比，Epsilonproteobacteria 僅在中度咸水(M1)樣品中發現. 此外，Deltaproteobacteria 在重度咸水(S)樣品中的豐度高于其他樣品，而Zetaproteobacteria 在所有樣品中的豐度都很低.

2.3 微生物群落在不同鹽度梯度上的變化

利用群落隸屬關系對含水層微生物群落進行比較，探討微生物群落分布沿含水層鹽度梯度的空間變化(見圖2). 樣本間OTUs 網絡分析表明，相對于其他鹽度的含水層樣品，中度咸水(M1)和微咸水(M2)地下水樣品微生物群落結構更相似. 因此，為了更加清晰地顯示微生物群落在鹽度梯度上的分布，把中度咸水(M1)和微咸水(M2)地下水樣品合并起來共稱為咸水樣品(M). 維恩圖展示了共有和獨有的OTUs 數量在3 個鹽度梯度上的分布(見圖2). 從22 個地下水樣品中產生的1 427 個OTUs 中可以看出，3 個鹽度差異的微生物群落之間共有的OTUs 占比高達59%(837 個OTUs). 此外，兩個樣品的微生物群落之間共有的OTUs 約占18% (257 個OTUs). 維恩圖結果顯示，不同鹽度的樣品之間有很多共同的OTUs，在一定程度上也說明含水層中淡水和咸水之間存在流通和交換作用.

特別是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在所有鹽度水體中占比都很高，微生物群落的相似性反映在屬水平的高豐度類群中，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)和Unclassified Enterobacteriaceae(見圖3). 重度咸水(S)中的高豐度類群是甲烷球菌屬(Methanococcus)、Candidatus Nitrosoarchaeum和海洋桿菌屬(Marinobacter)，分別隸屬于奇古菌門(Thaumarchaeota)、 廣古菌門(Euryarchaeota)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria).然而，在淡水樣品中占優勢的類群是β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，包括Norank Hydrogenophilaceae、Unclassified Methylophilaceae、 Denitratisoma 和Unclassified Rhodocyclaceae.

圖 2 樣本之間OTUs 網絡分析和維恩圖Fig.2 Network analysis of OTUs between samples obtained Venn diagram

圖 3 不同鹽度梯度下微生物群落(屬水平)的相對豐度Fig.3 The relative abundance of microbial taxa (genus level) along the salinity gradient

2.4 微生物群落結構及其與環境因子的相互關系

對微生物群落與主要環境因子進行典型相關分析. 結果顯示，前兩個CCA 軸中的環境參數共同解釋了微生物群落組成差異的23.7% (見圖4)，TDS 濃度(r2=0.63，P=0.001)和TN 濃度(r2=0.8，P=0.001)對微生物分布的影響最強，而溫度是最弱的環境變量. Spearman 相關分析(見表1)表明，厚壁菌相對豐 度與ORP 及HCO3—、DO 濃度均呈顯著負相關(P＜0.05). 擬桿菌相對豐度與ORP、pH 均呈顯著正相關，與Fe2+濃度呈顯著負相關，而α-變形桿菌相對豐度與TP 濃度呈顯著正相關(P＜0.05). β-桿菌相對豐度與HCO3—濃度呈顯著正相關，與Cl—、TDS 濃度均呈顯著負相關(P＜0.05). γ-變形菌綱相對豐度與TN濃度呈顯著正相關(P＜0.01). 在屬水平上，短小桿菌屬相對豐度與HCO3—、DO 濃度均呈負相關，不動桿菌屬相對豐度與HCO3—濃度呈負相關，假單胞菌屬相對豐度與ORP 及HCO3—、DO 濃度均呈負相 關(P＜0.05).

圖 4 微生物群落結構與環境因子的典范對應分析Fig.4 CCA analysis between microbial community structure and environmental fact

表 1 水體樣品在不同分類水平上的微生物群落相對豐度與環境因子之間的Spearman 相關性分析Table 1 Environmental factors associated with variations of the microbial communities at the phylum/class or genus level in the four water samples

3 討論

3.1 微生物的豐富度和多樣性

長期以來，對水體鹽度梯度下微生物多樣性的研究主要集中在地表水系統[31-32]. 該研究揭示了地下水中原核微生物群落的豐富度和多樣性，這些原核微生物所在的地下環境具有復雜的地球化學性質，可能發生了劇烈的生物地球化學過程. 由Chao1 和Shannon-Wiener 多樣性指數反映的微生物群落豐富度和均勻度沿鹽度梯度發生了變化，但變化并不明顯. 總體而言，在重度咸水(TDS 濃度＞10 g/L)中觀察到的微生物群落豐富度和多樣性最高，其次是淡水. 該研究結果與在海灣河口[33]和原始含水層[34]中觀察到的結果相反，他們認為鹽度的增加會導致細菌多樣性的減少，而在相對穩定的波羅的海河口[35]， Shannon-Wiener多樣性指數沿鹽度梯度的變化不明顯. 在微咸水(1 g/L＜TDS 濃度＜3 g/L)樣品中發現微生物群落的豐富度和均勻度最低，也就是說，雖然微生物多樣性并沒有完全遵循鹽度梯度變化規律，但在TDS 濃度＞1 g/L 的咸水中，微生物群落多樣性隨著鹽度的增加而增加[23,36-37]. 因此，微生物群落的α-多樣性與其所處的環境條件關系非常密切. 在環境波動較大的水體環境中[33-34]，地下水中微生物的Shannon-Wiener 多樣性指數由秋冬季的3.22±0.28顯著變化為春夏季的1.31±0.35，這是由于營養鹽、有機碳的輸入以及地下水位的強烈波動，引起微生物群落多樣性在不同季節具有顯著性差異. 而在該研究中，地下環境條件相對比較穩定，微生物的多樣性的變化并不明顯.

3.2 微生物的群落結構

結果顯示，地下水中的優勢菌群是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，與其他研究結果[38-39]相似，而古菌的群落結構主要是奇古菌門和廣古菌門. 值得注意的是，γ-變形菌綱豐富度在所有樣本中都比較高(見圖1). 一般來說，海水中的優勢細菌是α-或γ-變形菌綱，β-變形細菌在淡水中占優勢[40-41]. 該研究中，與咸水樣品相比，淡水樣品中的β-變形菌綱占比相對較高. 在咸水中檢測到豐度較高的類群主要包括脫硫弧菌屬、甲烷球菌屬和海洋桿菌屬，在其他樣品中幾乎未檢出(見圖3). 脫硫弧菌屬和產甲烷球菌屬中存在豐富的異養厭氧微生物，表明樣品的氧化還原電位較低. 先前的地質調查中就發現地層中有大量的甲烷氣體和臭雞蛋味的硫化氫氣體，表明含水層中存在微生物硫酸鹽還原和產甲烷作用[20]. 該研究中一些高濃度咸水樣品中檢測到的脫硫弧菌屬和甲烷球菌厭氧微生物，可能是地層中二氧化硫和甲烷氣體生成的微生物類群. 在咸水樣品中有豐度較高的海洋桿菌屬，是嗜鹽或者耐鹽性的物種，一般生存在海洋環境中[42]，而這些海洋物種序列很可能是在海水入侵的作用下被帶入海濱含水層. 在其他海濱土壤的研究中也發現了海洋物種序列[43]，研究者認為很可能是由于海水入侵作用被帶入海濱土壤. 這也表明了海濱含水層是海洋與內陸物種交換的重要場所，對微生物的地理分布起到一定作用[44].

較長的水體停留時間和相對穩定的環境有助于建立穩定的土著微生物群落生態系統[39]. 咸水與淡水微生物群落組成差異較大(見圖3)，然而維恩圖結果(見圖2)顯示，不同鹽度水體之間存在大量共有的OTUs，表明咸水與淡水之間可能存在著緊密的流動和交換聯系[20].

3.3 微生物群落與環境的關系

一般認為，水生微生物群落結構的時空變化和分布是環境因素綜合作用的結果. 該研究中，微生物群落與主要環境因子的典型相關分析表明，前兩個CCA 軸中的環境參數共同解釋了微生物群落組成差異的23.7% (見圖4)，TDS 濃度(r2=0.63，P=0.001)和TN 濃度(r2=0.8，P=0.001)對微生物分布的影響最強，而溫度的影響最弱. 根據對不同生態環境的全球調查結果，鹽度被視為是微生物群落變異的主要環境影響因子[45-46]. 該研究結果表明，TDS 和TN 是微生物群落最有力的驅動因素(見圖3). 鹽度是一個至關重要的環境變量，它與β-變形菌綱豐度呈負相關，這與在黃海沿岸海底地下水中的研究結果[14]一致. 有研究[21]表明，珠江三角洲地下水體中存在高達8.6×109kg 的氨氮污染物，并且這些數量巨大的氨氮有機物從地下弱透水層不斷釋放，可以解釋TN 對微生物群落的重要影響. 根據廣東省水文地質調查結果，珠江三角洲地下水中氨濃度高達560 mg/L，主要源于上覆的全新世-更新世中富含有機質的含水層，通過地下水輸送擴散進入含水層[21]，可能會逐漸遷移到河水和沿岸海水中，破壞生態平衡，需引起高度重視.

4 結論

a) 珠三角地區海水入侵區含水層中原核微生物群落中細菌以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門為主，而古菌以奇古菌門和廣古菌門為主，且古菌在咸水中豐富度更高.

b) 環境條件相對比較穩定的含水層中，微生物多樣性變化并不明顯.

c) 該研究中對地下水微生物群落影響最大的環境因子是溶解性總固體(TDS)和總氮(TN)濃度，含水層中大量的氨氮可能會對生態平衡造成一定影響，需引起高度重視.