miRNA-18a和miRNA-4802通過自噬抑制淋巴瘤細胞耐藥性的機制研究

周仕霞 李曉明 唐君玲

關鍵詞淋巴瘤細胞;耐藥性;miRNA-18a;miRNA-4802;自噬;機制

淋巴瘤尤其非霍奇金淋巴瘤是危害人類健康的重大疾病[1]。淋巴瘤患者在臨床上常使用環磷酰胺、阿霉素（adriamycin，ADR）、長春新堿（vincristine，VCR）和博來霉素等的聯合化療方案進行治療;近年來，單克隆抗體靶向藥物的發展也大大改善了淋巴瘤患者的臨床治療現狀[2-3]。然而，在臨床治療過程中，淋巴瘤細胞的耐藥性會嚴重威脅化療效果和患者預后[4-6]。所以，闡明淋巴瘤細胞的耐藥機制具有重要的臨床應用價值。

自噬是細胞在環境壓力條件下進行的一種非常重要的細胞代謝機制，呈現高度的進化保守性[7]。相關研究表明，在淋巴瘤中，自噬介導的細胞凋亡是多種化療藥物的重要作用機制[8-10];然而，也有研究表明，自噬可以顯著增強淋巴瘤細胞對特定單一化療藥物或多種化療藥物的耐藥性[11-14]，但其具體分子機制尚不明確。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小分子RNA，其在基因表達調控領域中起著重要作用。本課題組前期研究發現，miRNA-18a、miRNA-4802 與細胞耐藥性之間存在相關性。基于此，本研究以人Burkitt’s 淋巴瘤細胞和人套細胞淋巴瘤細胞為研究對象，使用ADR和VCR 進行處理，再以miRNA-18a、miRNA-4802 以及細胞自噬作為研究切入點，探討2 個miRNA對淋巴瘤細胞耐藥性的影響及調控機制，以期為淋巴瘤耐藥性的機制闡明及淋巴瘤治療藥物開發提供參考，同時也為淋巴瘤的臨床治療提供新的潛在靶點。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HR40-ⅡA2 型生物安全柜（海爾集團公司），GX53 型倒置熒光顯微鏡、BX53M型正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），SCO6AD-2 型二氧化碳培養箱、Milli-Q 型水純化系統、ST 40R型低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），TGL-16M型常溫離心機、DK 8D型恒溫水浴鍋（湖南湘儀科教儀器有限公司），TriStar2LB942 型多功能微孔板酶標儀（北京科瑞恩特科技有限公司），12kV HT7800 型透射電鏡[柜谷科技發展（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

RPMI-1640 細胞培養基、胎牛血清（批號分別為11875-093、26010066）購于美國Thermo Fisher Scientific公司;細胞增殖檢測試劑盒（批號CK04）購于北仁化學科技（北京）有限公司;細胞裂解液、Ad-mCherry-GFP-LC3 腺病毒（批號分別為20200407、CA100008M）均購于上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人微管相關蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）單克隆抗體、兔抗人p62 單克隆抗體、兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為14600-1-AP、KHC0058、23660-1-AP）均購于武漢三鷹生物技術有限公司;兔抗人unc-51 樣激酶（ULK1）單克隆抗體、兔抗人自噬相關蛋白7（ATG7）單克隆抗體、兔抗人活化型胱天蛋白酶9（cleaved caspase-9）單克隆抗體、兔抗人cleaved caspase-6單克隆抗體（批號分別為A7481、A2856、SAB4503337、SAB4500330）均購于美國Sigma 公司;模擬生物體內源的miRNAs（miRNA mimics，批號AF04-20201004）購于上海生工生物工程有限公司。其余試劑為實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

人Burkitt’s 淋巴瘤細胞Daudi 和人套細胞淋巴瘤細胞JeKo-1 均購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

Daudi 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，JeKo-1 細胞培養于含20% 胎牛血清的RPMI-1640 培養基中。2 種細胞均置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養箱中進行培養。細胞呈單個懸浮生長。

2.2 Daudi 細胞和JeKo-1 細胞對ADR和VCR耐藥性的考察將Daudi 細胞和JeKo-1 細胞以2 000 個/孔接種于96孔板中，分別分為對照組、ADR組（1 μg/mL，質量濃度設置參考前期預實驗結果）、VCR組（1 μg/mL，質量濃度設置參考前期預實驗結果），另設不加細胞只加培養基的空白組，每組設10 個復孔。對照組加入磷酸鹽緩沖液100 μL，其余各給藥組加入相應藥液100 μL，培養72 h后，各組加入CCK-8 試劑10 μL，繼續培養1.5 h。采用酶標儀于450 nm波長處檢測各組吸光度（OD）值，并計算細胞的相對活性[相對活性=（給藥組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）]。

相對活性檢測結束后，采用Western blot 法進行2 種凋亡標志蛋白表達水平的檢測。取ADR組、VCR組細胞適量，以細胞裂解液提取總蛋白，經變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳，然后進行封閉、孵育抗體、顯影等操作，以檢測2 種細胞中cleavedcaspase-9 和cleaved caspase-6 的表達水平（以β-actin 蛋白為內參）。

2.3 Daudi細胞和JeKo-1細胞自噬活性的考察

2.3.1 2 種自噬相關蛋白表達水平檢測取Daudi 細胞和JeKo-1 細胞適量，以細胞裂解液提取總蛋白，按“2.2”

項下Western blot 法操作，檢測2 種細胞中LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達水平（以β-actin蛋白為內參）。

2.3.2 自噬流實驗取Daudi 細胞和JeKo-1 細胞適量，接種于裝有細胞爬片（已經多聚賴氨酸處理）的24 孔板內，待細胞融合度為60%～70%時，將培養基換成不含雙抗的完全培養基，并根據預實驗確定的最佳感染復數值加入適量Ad-mCherry-GFP-LC3腺病毒溶液，感染48 h后，取出細胞爬片，并以磷酸鹽緩沖液清洗3 次;于載玻片上滴加適量防熒光猝滅劑，并將細胞爬片（有細胞的一面）覆于其之上，再采用熒光顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白的分布和形態。

2.3.3 透射電鏡觀察取Daudi 細胞和JeKo-1 細胞適量，經消化、離心后收集細胞，以2.5%戊二醛溶液固定24 h，再以1%鋨酸溶液固定3 h 后，于4 ℃條件下進行梯度脫水、包埋、固化、切片（厚度為70 nm）;將切片以3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛溶液染色6 h 后，采用透射電鏡觀察2種細胞中的自噬溶酶體并計數。

2.4 Daudi 細胞和JeKo-1 細胞中miRNA-18a、miRNA-4802和ULK1、ATG7的表達差異考察

取Daudi 細胞和JeKo-1 細胞適量，使用試劑盒提取2種細胞的總RNA，再分別使用相應試劑盒進行miRNA-18a 和miRNA-4802、ULK1 和ATG7 的逆轉錄，合成相應cDNA;再以cDNA為模板，進行熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR），具體引物序列見表1。PCR反應體系（共10 μL）：TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，水3.2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環39 次。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-18a、miRNA-4802 和ULK1、Atg7 mRNA的表達水平。另外，取Daudi細胞和JeKo-1 細胞適量，以細胞裂解液提取總蛋白，按“2.2”項下Western blot 法操作，檢測2 種細胞中ULK1、ATG7蛋白的表達水平（以β-actin蛋白為內參）。

2.5 JeKo-1 細胞經miRNA-18a mimics 處理后自噬活性的變化考察

將JeKo-1細胞分為Control mimics處理組和miRNA-18a mimics 處理組，miRNA-18a mimics 處理組細胞加入miRNA-18a mimics 適量進行轉染（Control mimics 處理組不作任何處理）。然后取2 組細胞適量，分別進行Western blot 實驗（以檢測各組細胞中ULK1、LC3-Ⅱ、p62 蛋白的表達水平）、自噬流實驗（以檢測各組細胞中LC3-Ⅱ蛋白的分布和形態）、透射電鏡觀察（以檢測各組細胞中自噬溶酶體的數量）。

2.6 JeKo-1 細胞經miRNA-4802 mimics 處理后自噬活性的變化考察將JeKo-1細胞分為Control mimics處理組和miRNA-4802 mimics 處理組，同“2.5”項下方法處理并進行相應實驗（其中Western blot 實驗中檢測ATG7、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達水平）。

2.7 JeKo-1 細胞經miRNA-18a mimics 和miRNA-4802mimics處理后耐藥性的變化考察取JeKo-1 細胞適量，以ADR（1 μg/mL）干預后，分為Control mimics 處理組、miRNA-18a mimics 處理組、miRNA-4802 mimics 處理組。另取JeKo-1 細胞適量，以VCR（1 μg/mL）干預后，同樣分為上述3 組。各組細胞按“2.5”項下方法處理后，再按“2.2”項下方法檢測細胞相對活性和凋亡標志蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達水平。

2.8 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，數據以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 Daudi 細胞和JeKo-1 細胞對ADR和VCR的耐藥性考察結果

經ADR處理后，Daudi 細胞和JeKo-1 細胞的相對活性與其各自的對照組相比分別降低至51%和70%（P<0.001）;經VCR處理后，Daudi 細胞和JeKo-1 細胞的相對活性分別降低至41%和72%（P<0.001）。Western blot實驗結果顯示，經ADR、VCR處理后，Daudi 細胞中凋亡標志蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達水平均顯著高于JeKo-1 細胞（P<0.01 或P<0.001）。結果見圖1。這表明，與Daudi 細胞相比，JeKo-1 細胞對ADR和VCR具有更強的耐藥性。

3.2 Daudi細胞和JeKo-1細胞自噬活性的考察結果Western blot 實驗結果顯示，與Daudi 細胞相比，JeKo-1 細胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達水平顯著升高，p62 蛋白的表達水平顯著降低（P<0.001）。自噬流實驗結果顯示，JeKo-1 細胞中LC3-Ⅱ蛋白的熒光斑塊明顯，自噬活性較強;Daudi 細胞中LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊不明顯，自噬活性較弱。透射電鏡觀察結果顯示，與Daudi 細胞[自噬溶酶體數量為（0.2±0.1）個]相比，JeKo-1細胞中自噬溶酶體數量[（2.4±0.1）個]顯著增多（P<0.01）。結果見圖2。這表明，JeKo-1細胞的自噬活性顯著高于Daudi細胞。

3.3 Daudi 細胞和JeKo-1 細胞中miRNA-18a、miRNA-4802和ULK1、ATG7的表達差異考察結果qRT-PCR 實驗結果顯示，Daudi 細胞中miRNA-18a和miRNA-4802 的表達水平均顯著高于JeKo-1 細胞，JeKo-1 細胞中ULK1、ATG7 mRNA 的表達水平均顯著高于Daudi 細胞（P<0.001）。Western blot 實驗結果顯示，JeKo-1 細胞中ULK1、ATG7 蛋白的表達水平均顯著高于Daudi 細胞（P<0.001）。結果見圖3。這提示miRNA-18a、miRNA-4802 可能對自噬啟動基因ULK1、ATG7 起負調控作用。

3.4 miRNA-18a mimics 處理JeKo-1 細胞后自噬活性的變化Western blot 實驗結果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細胞中ULK1、LC3-Ⅱ蛋白表達水平均顯著降低，p62 蛋白表達水平顯著升高（P<0.001）。自噬流實驗結果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細胞中無明顯LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊。透射電鏡觀察結果顯示，與Control mimics 處理組[自噬溶酶體數量為（2.9 ± 0.1）個] 相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細胞中自噬溶酶體數量[（0.2±0.1）個]顯著減少（P<0.01）。結果見圖4。這表明，經miRNA-18a mimics處理后，JeKo-1 細胞的自噬活性降低。

3.5 miRNA-4802 mimics 處理JeKo-1 細胞后自噬活性的變化Western blot 實驗結果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-4802 mimics 處理組JeKo-1 細胞中ATG7、LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著降低，p62 蛋白表達水平顯著升高（P<0.001）。自噬流實驗結果顯示，與Controlmimics 處理組相比，miRNA-4802 mimics 處理組JeKo-1 細胞中無明顯LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊。透射電鏡觀察結果顯示，與Control mimics處理組[自噬溶酶體數量為（3.6±0.1）個]相比，miRNA-4802 mimics處理組JeKo-1細胞自噬溶酶體數量[（0.3 ± 0.1）個] 顯著減少（P<0.01）。結果見圖5。這表明，經miRNA-4802 mimics 處理后，JeKo-1 細胞的自噬活性降低。

3.6 JeKo-1 細胞經miRNA-18a mimics 和miRNA-4802mimics處理后耐藥性的變化細胞相對活性實驗結果顯示，使用miRNA-18amimics 和miRNA-4802 mimics 處理后，JeKo-1 細胞對ADR、VCR 的耐藥性均顯著降低（P<0.001）。Westernblot 實驗結果顯示，經miRNA-18a mimics 和miRNA-4802 mimics 處理后，ADR、VCR均可顯著升高JeKo-1 細胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達水平（P<0.001）。結果見圖6。這表明，miRNA-18a mimics和miRNA-4802 mimics 很可能通過抑制淋巴瘤細胞的自噬活性來抑制其對ADR和VCR的耐藥性。

4 討論

淋巴瘤細胞的耐藥性一直是淋巴瘤基礎研究和臨床診療的重要關注點[15]。淋巴瘤細胞的耐藥性是指淋巴瘤細胞通過多種途徑實現減少或者阻止化療藥物的殺傷力，從而實現促進自身生存的目的。一般情況下，淋巴瘤細胞常通過以下途徑實現耐藥性：減少化療藥物進入細胞內;增加化療藥物排出細胞外;改變細胞代謝途徑;增強化療藥物致DNA損傷的修復;抑制化療藥物引起的細胞凋亡[16-18]。相關研究發現，上述多種途徑均有細胞自噬過程的參與，尤其在增強DNA修復和抑制細胞凋亡過程中，自噬發揮著重要作用[19-22]。

自噬在細胞內受多種途徑的分子調控，其核心調控機制主要包括雷帕霉素信號通路和腺苷酸活化蛋白激酶通路[23 - 25]。值得注意的是，某些非編碼RNA，如miRNA 已被證實廣泛參與細胞自噬的調節過程[26-27]。

基于此，本研究聚焦miRNA 對淋巴瘤細胞自噬的調控過程。自噬小體的觸發和延展是成熟的分子調控過程，該過程中涉及3 個關鍵的自噬小體起始蛋白復合物，其中ULK1 基因編碼的蛋白質與ATG13 蛋白、200 kDa 的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinasefamily interacting protein of 200 kDa，FIP200）形成的蛋白復合物則是其中之一[28-29]。ULK1 不僅是自噬小體起始蛋白復合物的關鍵組成部分，還對Beclin1、ATG14L和VPS34 復合物等自噬關鍵起始因子具有磷酸化作用，也對自噬小體的順利延展起到不可替代的作用[30]。相關研究發現，自噬的激活和自噬小體的延展需要依靠細胞內多種自噬相關蛋白參與的類泛素化調控系統，其中，ATG7 蛋白可以發揮類泛素化激活酶E1 的作用，與ATG12 蛋白結合后轉運至ATG5 蛋白;另外，ATG10 蛋白可以發揮類泛素化結合酶E2 的作用，促進ATG12-ATG5 蛋白復合物的形成，進而發揮類泛素化連接酶E3 的作用，最終完成ATG8 蛋白的酯化作用，形成ATG8-PE 蛋白復合物。ATG8-PE 蛋白復合物對招募自噬小體延展成分和自噬底物具有重要作用[31-32]。由此可見，ULK1 和ATG7 基因均為自噬進程的關鍵調控因子，其表達水平與細胞自噬活性直接相關。

本研究以人Burkitt’s 淋巴瘤細胞Daudi 和人套細胞淋巴瘤細胞JeKo-1 為研究對象，從ADR和VCR這2 種具有代表性的化療藥物入手，探索上述2 種細胞的耐藥性。經ADR和VCR處理后，與Daudi 細胞相比，JeKo-1細胞活性更高、凋亡水平更低。JeKo-1 細胞比Daudi 細胞具有更強的自噬活性，并且JeKo-1 細胞中miRNA-18a和miRNA-4802 的表達水平更低，ULK1、Atg7 mRNA表達水平更高;進一步使用miRNA-18a mimics 和miRNA-4802 mimics 處理JeKo-1 細胞后發現，細胞自噬水平受到顯著抑制，且對ADR和VCR的耐藥性顯著降低。由此推測，miRNA-18a 和miRNA-4802 很可能是通過靶向負調控ULK1、ATG7 mRNA的表達水平，進而抑制淋巴瘤細胞的自噬和耐藥性。

綜上所述，miRNA-18a 和miRNA-4802 分別通過降低自噬啟動基因ULK1 和Atg7 的表達，抑制淋巴瘤細胞的自噬活性，從而降低淋巴瘤細胞對ADR和VCR的耐藥性。