過氧化麥角甾醇衍生物對人三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

張宏宇 任文康 鄒宇 韓迎龍 楊宏艷 卜明 都曉輝 林宇

關鍵詞過氧化麥角甾醇衍生物;乳腺癌細胞;EP-3P;三陰性乳腺癌;遷移;侵襲;凋亡

全球最新癌癥負擔數據顯示，2020 年全球乳腺癌新發病例高達226 萬例，超過了肺癌的220 萬例，已成為全球第一大癌癥[1]。雖然隨著化療、內分泌治療、靶向治療等綜合治療手段的運用，癌癥患者的病死率已大幅度下降，但我國仍約有7.82%的女性因乳腺癌復發或轉移而死亡[2]。因此，探尋治療乳腺癌的有效藥物仍然是亟待解決的問題。

從天然產物中尋找抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，并對其結構進行改造或修飾，已成為國內外研究的重點內容之一。過氧化麥角甾醇（ergosterol peroxide，EP）是一種過氧化甾體類天然產物，廣泛存在于多種真菌中[3-4]。已有大量文獻報道，EP可通過細胞毒性作用抑制癌細胞生長[5-7]。研究發現，EP 作為一種重要的活性先導化合物，其特有的5α，8α-過氧橋是關鍵藥效載體[8-10]。EP的C-3 位和C-17 位具有較大的結構修飾空間，如Li 等[11]、Han 等[12]分別在EP 的C-17 位引入吲哚醌取代基和酰肼側鏈合成了新的化合物，并發現上述合成的化合物均可顯著抑制癌細胞的增殖、誘導癌細胞凋亡;再如Bu 等[13]發現，在EP的C-3 位引入氨基甲酸酯極性基團對提升其抑制腫瘤細胞增殖的活性至關重要。

紫杉醇是一種公認的治療乳腺癌的藥物，其結構中的C-13 側鏈與其抗腫瘤作用密切相關[14]。為進一步推進EP 結構衍生化研究，篩選具有更強抗腫瘤活性的新化合物，本課題組前期以EP作為先導化合物，通過在其C-3 位羥基引入紫杉醇的側鏈（4S，5R）-3- 叔丁氧羰基-2，2-二甲基-4-苯基-1，3- 唑烷-5-甲酸，合成了全新的EP衍生物EP-3P（結構見圖1）。本研究擬通過體外實驗初步考察EP-3P 對人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制，以期為乳腺癌治療相關藥物的開發研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括：Axio observer A1 型倒置顯微鏡（德國Zeiss 公司），SAFIRE2 型多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司），Power/PAC3000 型電泳儀、Chemi-Doc MP型凝膠成像儀、FACS Calibur 型流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑包括：EP-3P（由齊齊哈爾醫學院藥物化學研究室提供，批號20211020，經高效液相色譜法和核磁共振法檢測其純度均在98%以上），L-15 培養基、胎牛血清（美國Hyclone 公司），重組胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜（DMSO）、MTT細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒（批號C0038）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（批號P0010）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號1753025），細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGA512），Matrigel 基質膠（美國BD 公司，批號356234），鼠源B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和兔源Bcl-2 相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）、活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）8 種單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Cell Signaling Technology 公司），ECL發光試劑盒（北京康為世紀生物科技股份有限公司，批號CW0049），其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

將MDA-MB-231 細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的L-15 培養基中，置于37 ℃、無CO2的培養箱中培養。本研究選用傳代6～10代的細胞進行實驗。

2.2 EP-3P對MDA-MB-231 細胞增殖的影響

采用MTT 法進行檢測。取對數生長期的MDAMB-231 細胞，胰酶消化后用L-15 完全培養基稀釋成2×104個/mL 的細胞懸液，將細胞懸液按100 μL/孔接種于96 孔板中。實驗設置空白對照組（不加任何藥物處理培養的細胞，即0 μmol/L）、EP-3P 不同濃度組（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，藥物濃度根據前期預實驗結果設置），每組平行設置3 個復孔;并設置空白調零孔（不加細胞，只加培養液）。分別在培養24、48、72 h 時，每孔加入0.5mg/mL 的MTT 溶液10 μL，培養箱中常規培養4 h 后棄去MTT，再每孔加入150 μL DMSO振蕩30 min 溶解甲瓚結晶;然后采用多功能酶標儀測定各孔在490 nm波長處的光密度值，并計算細胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=[1-（給藥組光密度值-空白調零孔光密度值）/（空白對照組光密度值- 空白調零孔光密度值）]×100%。實驗重復3 次。

2.3 EP-3P對MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕法進行檢測。取對數生長期的MDA-MB-231 細胞，以1×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，常規培養過夜，然后采用無菌槍頭在垂直于板的橫軸方向劃出等寬的直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞3 次。將細胞分為空白對照組（0 μmol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20 μmol/L，濃度根據“2.2”項下MTT實驗結果和本課題組前期預實驗結果設置，下同），每組設置3 個復孔。分別在培養0、24 h 后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況，并拍照。利用Image J V1.8.0 軟件測定劃痕面積，計算細胞的遷移愈合率：遷移愈合率（%）=（0 h 時劃痕面積-24 h 時劃痕面積）/0 h 時劃痕面積×100%。實驗重復3 次。

2.4 EP-3P對MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響

采用Transwell 小室法進行檢測。將Matrigel 基質膠與無血清培養基按照體積比1 ∶8 混勻后，按50 μL/孔的量加入到Transwell 小室上層。將細胞侵襲小室置于培養箱中，將Matrigel 烘干，然后棄掉多余的培養基。取對數生長期的MDA-MB-231 細胞，制成1.5×105 個/mL的細胞懸液，分別給予0（空白對照組）、5、10、20 μmol/L的EP-3P（EP-3P不同濃度組）刺激，每個濃度組設置3 個平行組。然后分別取上述給藥后的細胞懸液100 μL 加入到Transwell 小室上層，下層中加入含10%胎牛血清的培養基700 μL。將細胞侵襲小室置于培養箱中培養24 h，然后以4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結晶紫染色30 min 后，于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細胞。每個樣本計數5 個視野，取平均值作為檢測結果。實驗重復3 次。

2.5 EP-3P對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法進行檢測。取對數生長期的MDA-MB-231 細胞，常規制備細胞懸液后，將細胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養24 h后，按照“2.3”項下方法分組與給藥。繼續培養24 h 后，收集、洗滌細胞，先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 試劑各5μL，混勻，于室溫下避光反應15 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并通過Flow jo 10 軟件分析各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

2.6 EP-3P對MDA-MB-231 細胞周期分布的影響

采用流式細胞術進行檢測。取對數生長期的MDAMB-231 細胞，按照“2.5”項下方法接種、分組、給藥、培養并收集。制備細胞密度為1×106個/mL的單細胞懸液，離心（2 000 r/min，5 min）去除上清，加入70%冷乙醇500 μL，4 ℃固定過夜;用預冷的PBS洗細胞3 遍，除去殘留的乙醇;加入500 μL 提前配制好的PI/RNase A染色液（臨用前PI 與RNase A染色液按9 ∶1 的體積比配制），37 ℃避光孵育30 min 進行染色，采用流式細胞儀檢測，并通過Flow jo 10軟件分析細胞周期分布。實驗重復3次。

2.7 EP-3P對MDA-MB-231 細胞中凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響

采用Western blot 法進行檢測。取對數生長期的MDA-MB-231 細胞，制成單細胞懸液后，以8×105個/皿的細胞密度接種于直徑為60 mm的細胞培養皿中，待細胞培養至貼壁后，將細胞分為空白對照組（0 μmol/L）和EP-3P 不同濃度組（5、10、20 μmol/L）。藥物作用24 h后，每個培養皿加入PMSF 和RIPA 裂解液的混合液（PMSF 和RIPA裂解液的體積比為1 ∶100）500 μL，于冰上裂解細胞30 min，提取細胞中總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，并將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白樣品30 μg，在80 V電壓下進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在300 mA恒流下將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h;加入內參蛋白GAPDH一抗（稀釋比例1 ∶5 000）和目標蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9 一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次，加入相應二抗（稀釋比例均為1 ∶3 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液漂洗10 min×3 次，加ECL發光液，然后于凝膠成像儀中成像。用Image J V1.8.0 軟件對蛋白條帶進行分析，以目標蛋白條帶灰度值與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。實驗重復3次。

2.8 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料采用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 EP-3P對MDA-MB-231 細胞增殖的影響結果

與空白對照組比較，不同濃度EP-3P 作用于MDA-MB-231 細胞24、48、72 h 后，細胞的增殖抑制率均不同程度地升高，并呈一定的濃度和時間依賴趨勢。其中，除EP-3P 1.25 μmol/L組細胞在培養24 h 時的增殖抑制率外，其余各濃度EP-3P組細胞在藥物作用24、48、72 h后的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。各組細胞的增殖抑制率測定結果見表1。

3.2 EP-3P對MDA-MB-231 細胞遷移和侵襲能力的影響結果

與空白對照組比較，EP-3P 10、20 μmol/L 組細胞的遷移愈合率顯著降低（P<0.01），EP-3P 5、10、20 μmol/L組穿過基底膜的侵襲細胞數顯著減少（P<0.01），且均呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖2、圖3和表2。

3.3 EP-3P對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響結果

與空白對照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細胞的凋亡率顯著升高（P<0.05），且呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖4、表3。

3.4 EP-3P對MDA-MB-231 細胞周期分布的影響結果

與空白對照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L組G0/G1期細胞占比顯著降低（P<0.05 或P<0.01），G2/M期細胞占比顯著升高（P<0.05 或P<0.01），且呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖5、表3。

3.5 EP-3P對MDA-MB-231 細胞中凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響結果

與空白對照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細胞中Bcl-2、MMP-9 蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01），而Bax 蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01）;EP-3P 10、20 μmol/L 組細胞中caspase-3、MMP-2 蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01），而Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01）。結果見圖6、表4。

4 討論

EP 具有抗病毒、抗癌、抗真菌等藥理作用[15-16]。近年來，EP的抗腫瘤作用也逐漸受到研究者的關注。研究發現，EP 可抑制17β-雌二醇誘導的乳腺癌細胞MCF-7的增殖活性[17]。El-Sherif 等[5]首次從埃及樹脂靈芝菌絲體中分離得到EP，并發現其在體外可顯著抑制乳腺癌細胞MCF-7 的增殖。據文獻[18]報道，EP可抑制乳腺癌細胞SUM-149、MDA-MB-231 的增殖，誘導其凋亡，并可抑制細胞中蛋白激酶B、細胞周期蛋白D1 和原癌基因c-Myc 調控蛋白的表達，從而抑制細胞的遷移和侵襲。然而EP的抗腫瘤作用及機制尚不清楚。本課題組在前期藥物篩選時發現，EP的衍生物EP-3P對MDA-MB-231細胞的半數抑制濃度（IC50）為（11.29±3.13）μmol/L，對正常人乳腺細胞CCD-1095Sk 的IC50 為（54.73±2.48）μmol/L;而EP 對MDA-MB-231 細胞的IC50 為（20.54±1.98）μmol/L。上述結果表明，EP-3P 對MDA- MB-231細胞增殖的抑制作用明顯強于EP，且其對正常乳腺細胞的毒性作用較弱。本研究中MTT實驗和細胞周期實驗檢測結果顯示，EP-3P 作用后對MDA-MB-231 細胞的增殖有一定抑制作用，可將細胞周期阻滯于G2/M期，還可有效抑制細胞的遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，并具有一定的濃度依賴趨勢。

Bcl-2 家族是細胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，其在線粒體介導的內源性凋亡通路中起著重要作用[19]。該家族中的Bcl-2 和Bax 蛋白分別具有抑制和促進細胞凋亡的作用，可通過調節線粒體膜的通透性來調控線粒體凋亡途徑[20]。在正常狀態下，Cyt-C 位于線粒體外膜，當外膜通透性增加時，Cyt-C 進入細胞質，引起caspase 級聯放大反應，導致caspase-3 進入活化狀態（即cleaved-caspase-3）;活化的caspase-3 可裂解細胞內生物酶結構中的天冬氨酸殘基肽鍵，使酶失活，從而導致細胞凋亡[21]。本研究結果顯示，EP-3P作用于MDA-MB-231細胞后，可以誘導細胞中Bcl-2、caspase-3 蛋白表達下調和Bax、Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白表達上調。該結果提示，EP-3P可能通過上調細胞中Bax 蛋白表達、下調細胞中Bcl-2 蛋白表達，介導線粒體的內源性途徑來誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

MMP-2 和MMP-9 是MMPs 家族的重要成員，可參與腫瘤細胞轉移的調控。已有相關報道證實，MMP-2 和MMP-9 的高表達可能與乳腺癌的高轉移潛能有關[22-23]。本研究發現，EP-3P 可以有效抑制MDA-MB-231 細胞中MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達，表明EP-3P 可能是通過抑制MMP-2 和MMP-9 表達從而影響MDA-MB-231 細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，EP-3P 可通過線粒體介導的內源性caspase途徑抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 的增殖、遷移和侵襲，并可誘導細胞發生凋亡。本研究結果為后續研究EP-3P 抗乳腺癌作用機制提供了一定參考，但本研究僅采用單一的乳腺癌細胞系進行了實驗，有關EP-3P 對其他腫瘤細胞及其抗乳腺癌的相關機制有待進一步探討。同時，衍生物EP-3P 抑制乳腺癌細胞轉移和凋亡的作用是否優于其先導化合物EP，尚需進一步驗證。