文拉法辛聯合長春西汀在大鼠體內的藥代動力學研究

麥麥提艾力·色依提 孫鈺淑 孫玲 李文芳 劉茜

關鍵詞文拉法辛;長春西汀;藥代動力學;藥物相互作用;代謝;大鼠

抑郁癥是一種由生理、心理以及社會環境因素等導致的臨床常見復雜疾病。抑郁癥患者情緒低落、悲觀，生理上表現為思維遲緩、失眠、軀體不適，當抑郁癥發展到嚴重階段，甚至會產生自殘自殺行為[1]。抑郁癥難以治愈，復發率高，29%～66%的抑郁癥患者使用單一抗抑郁藥物進行治療時不能完全恢復[2-4]。

文拉法辛（venlafaxine，VEN）為第2 代非三環苯乙胺類抗抑郁藥，通過阻滯突觸前膜的5-羥色胺、去甲腎上腺素以及部分多巴胺重攝取從而治療抑郁癥[5]。VEN口服吸收速度快，不良反應小，是治療抑郁癥尤其是難治性抑郁癥的首選藥物之一[6-7]。VEN體內主要代謝產物是N-去甲文拉法辛（N-desmethylvenlafaxine，NDV）和O-去甲文拉法辛（O-desmethylvenlafaxine，ODV），其中ODV 由VEN 通過細胞色素P450（CYP450）酶CYP2D6（89%）、CYP2C19（10%）和CYP2C9（1%）代謝生成，具有抗抑郁活性，且作用效果與VEN類似[8]。歐洲精神病藥理學會與神經精神藥理學會發布的治療藥物監測指南中推薦對VEN及ODV的血藥濃度進行監測[9]。

長春西汀（vinpocetine，VIN）可抑制鈣離子依賴性磷酸二酯酶的活性，增加環磷酸腺苷的含量，松弛血管平滑肌，增加腦灌注量，常用于治療心血管疾病及抑郁癥[10]。VIN體內吸收快速，約75%被迅速水解為活性代謝物阿樸長春胺酸（apovincaminic acid，AVA），致使VIN在血漿中的濃度較低。VIN 和AVA藥理活性具有顯著的相關性，檢測AVA 即可反映VIN 的藥代動力學行為[11-12]，因此本研究只測定AVA的血藥濃度。

患者抑郁癥發作時，進行VEN聯合VIN 治療，可明顯降低其漢密爾頓焦慮量表評分，且療效較單用VEN明顯提高[13-14]。VEN代謝過程中涉及多種CYP450同工酶，而VIN對其中CYP3A4、CYP2D6 均有一定抑制作用，從而影響VEN 的代謝[15-16]。基于此，本研究采用液相色譜- 串聯質譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中VEN、ODV、AVA 的濃度，進而研究VIN 聯用VEN 的藥代動力學，考察兩者的相互作用，以期為兩者合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）、API2000 型三重四極桿質譜儀（美國ABSciex 公司）、管式加熱L-119A型氮吹儀[來亨科技（北京）有限公司]、DW-86W100 型臥式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）、BS 124S 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、LG10-2.4A型高速離心機（北京雷勃爾離心機有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑本研究所用主要藥品與試劑有VIN對照品（廣東健坤藥業有限公司，含量100.2%，批號151221-41815003），VEN、ODV對照品（上海麥克林生化科技有限公司，含量均大于99.5%，批號分別為M00118009、C10034477），AVA對照品（國家標準物質資源平臺，含量99.5%，批號101439-201901），多潘立酮對照品（信陽市中檢計量生物科技有限公司，含量99.8%，批號100304-201103）;甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，甲基叔丁基醚、無水碳酸鈉為分析純，其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物本研究所用動物為SPF 級雄性SD 大鼠，體質量為180～200 g，購自沈陽藥科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（遼）2019-0058。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件（1）色譜條件一（檢測VEN、ODV）：

色譜柱為Agilent TC-C1（8 150 mm×4.6 mm，5 μm），保護柱為Agilent-C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（50 ∶ 45 ∶ 5，V/V/V）;流速為800μL/min;柱溫為40 ℃。（2）色譜條件二（檢測AVA）：色譜柱為Agilent TC-C1（8 150 mm×4.6 mm，5 μm），保護柱為Agilent-C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇-乙腈溶液（85 ∶15，V/V）;流速為800 μL/min;柱溫為40 ℃。

2.1.2 質譜條件采用電噴霧離子源，正離子檢測，多反應監測掃描;離子源溫度為450 ℃，離子源噴射電壓為5.5 kV;氣簾氣壓力為20 psi;噴霧氣、輔助加熱氣壓力均為70 psi;碰撞氣體壓力為7 psi;VEN、ODV、AVA及多潘立酮（內標）的去簇電壓分別為22、23、100、55eV，碰撞能量分別為30、34、33、37.2 eV;定量分析離子對分別為m/z 278.1→m/z 121.0（VEN）、m/z 264.1→m/z107.0（ODV）、m/z 323.2→m/z 236.1（AVA）、m/z 426.1→m/z 175.1（內標）。VEN、ODV、AVA和多潘立酮的全掃描質譜圖及化學結構見圖1。

2.2 標準溶液的配制精密稱定VEN、ODV、AVA對照品各10 mg，分別置于100 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，即得VEN、ODV、AVA質量濃度均為100 μg/mL的儲備液。取上述各成分儲備液適量，分別用甲醇稀釋成質量濃度均為5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列標準溶液。同法制備VEN、ODV、AVA質量濃度均分別為10、100、4 000ng/mL的質控（QC）工作溶液。

2.3 標準血漿樣品與QC樣品的配制取VEN、ODV、AVA相同質量濃度的系列標準溶液各50 μL 于同一5 mL離心管中，共8 份，加入500 μL 空白血漿，配制成VEN、ODV、AVA質量濃度均分別為0.5、1、5、10、50、100、200、500 ng/mL 的標準血漿樣品，備用。另取VEN、ODV、AVA的QC工作溶液各50 μL，加入500 μL 空白血漿，渦旋1 min，制備VEN、ODV、AVA質量濃度均分別為1、10、400 ng/mL的QC樣品，備用。

2.4 血漿樣品的預處理方法2.4.1 VEN及ODV血漿樣品的預處理取100 μL大鼠血漿，加入200 ng/mL 內標溶液10 μL，渦旋1 min;加入0.1 mol/L 碳酸鈉溶液100 μL，渦旋1 min，再加入甲基叔丁基醚3 mL，渦旋震蕩20 min;以12 000 r/min 離心10min，取上清液，置于另一離心管，以37 ℃氮氣吹干，殘渣加100 μL 甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液復溶，取20 μL 進行LC-MS/MS分析。

2.4.2 AVA血漿樣品的預處理取100 μL大鼠血漿，加入200 ng/mL 內標溶液10 μL，渦旋30 s;加入1 mol/L 鹽酸100 μL，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，渦旋1 min;以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，置于另一離心管，以37 ℃氮氣吹干，殘渣加100 μL 甲醇-乙腈溶液復溶，取20 μL進行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學考察2.5.1 專屬性考察取大鼠空白血漿100 μL，除用10μL甲醇替代內標外，其余操作同“2.4”項下2 種血漿樣品的預處理方法分別處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析。按“2.3”項下方法操作，配制VEN、ODV、AVA、內標質量濃度分別為0.5、0.5、0.5、200 ng/mL 的標準血漿樣品，再按上述方法處理后進樣分析。取“2.6”項下給藥0.25 h 后單只大鼠血漿樣品，再按上述方法處理后進樣分析。結果顯示，VEN、ODV、內標的保留時間分別為1.85、1.85、1.86 min，AVA、內標的保留時間分別為3.12、2.94 min（均以標準血漿樣品計），表明該法血漿中內源性物質不干擾目標分析物。結果見圖2、圖3。

2.5.2 線性關系與定量下限考察取“2.3”項下配制的標準血漿樣品，按“2.4”項下2 種血漿樣品預處理方法操作，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄圖譜。以VEN、ODV、AVA質量濃度為橫坐標（X），VEN、ODV、AVA分別與內標的峰面積比值為縱坐標（Y），采用加權最小二乘法[17]進行線性回歸。結果顯示，VEN、ODV、AVA的回歸方程分別為Y=9.98×10-2X-0.061 2×10-2 （r=0.999 8）、Y=9.86×10-2X+3.81×10-2（r=0.998 1）、Y=9.17×10-2X+3.27×10-3（r=0.995 7），線性范圍均為0.5～500 ng/mL，定量下限均為0.5 ng/mL。

2.5.3 準確度與精密度考察按“2.3”項下操作，配制0.5 ng/mL 的VEN、ODV、AVA定量下限樣品，取“2.3”項下質量濃度分別為1、10、400 ng/mL 的QC樣品適量，按“2.4”項下方法操作，各質量濃度平行分析6 樣本，連續3個分析批。根據所建標準曲線，得各樣品的實測質量濃度，并考察日內、日間精密度[以相對標準偏差（RSD）表示]和準確度[以相對誤差（RE）表示]，結果見表1。

2.5.4 穩定性考察取VEN、ODV、AVA質量濃度均為1、400 ng/mL 的QC樣品，按“2.4”項下方法操作，各質量濃度平行分析3 樣本，分別考察血漿樣品處理前室溫放置2 h 和處理后室溫放置0、4、8 h 的穩定性，自動進樣器放置穩定性，3 次冷凍-解凍循環穩定性和長期穩定性（-70 ℃保存30 d）。結果顯示，VEN、ODV、AVA的不同QC樣品在上述條件下，實測質量濃度的RSD 均小于14%（n=3），穩定性良好。

2.5.5 提取回收率考察取“2.3”項下VEN、ODV、AVA質量濃度均為1、10、400 ng/mL 的QC樣品，按“2.4”項下方法操作，各質量濃度平行分析6 樣本，得峰面積均值A。取VEN、ODV、AVA 質量濃度均為10、100、4 000ng/mL的QC工作液各10 μL于不同離心管中，以氮氣吹干;另取大鼠空白血漿100 μL，除用10 μL甲醇替代內標外，其余按“2.4”項下方法操作，然后將上清液移至上述氮氣吹干的離心管中，渦旋使之充分溶解，再以氮氣吹干，加100 μL 甲醇復溶后進樣分析，各質量濃度平行分析6 樣本，得峰面積均值B。內標同法操作。按公式計算提取回收率（提取回收率=A/B×100%），結果見表2。2.5.6 基質效應考察取VEN、ODV、AVA質量濃度分別為1、400 ng/mL 的QC樣品各10 μL 和內標10 μL，以氮氣吹干;取大鼠空白血漿100 μL，除不加內標外，其余按“2.4”項下方法操作至取上清液，轉移上清液至上述氮氣吹干的離心管中，渦旋使之充分溶解，再以氮氣吹干，加流動相100 μL復溶，取20 μL進樣分析，各質量濃度平行分析6 樣本，得到峰面積均值A1。另外，除用水代替大鼠空白血漿外，其余處理同上，得到峰面積B1。以A1/B1計算得VEN、ODV、AVA和內標的基質因子，利用各成分和內標的基質因子計算經內標歸一化的基質因子。

結果顯示，VEN、ODV、AVA的1 ng/mL QC 樣品的基質因子變異系數分別為0.93%、0.98%、1.00%，400 ng/mLQC 樣品的基質因子變異系數分別為1.01%、0.96%、0.90%，符合生物樣品測定要求。

2.6 藥代動力學實驗將18 只健康雄性SD 大鼠，隨機分為VEN 組（13.5mg/kg）、VIN 組（1.8 mg/kg）和VEN+VIN 組（13.5 mg/kgVEN+1.8 mg/kg VIN），每組6 只，給藥劑量參考文獻[14]設置。給藥前，各組大鼠禁食不禁水12 h，一次性灌胃給予相應藥物。VIN 組于給藥前（0 h）和給藥后0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、6、8、12、24、36 h 采血;VEN組于給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、8、12 h 采血;VIN+VEN組于給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、6、8、12、24、36 h 采血。每只大鼠均從眼眶靜脈叢采血約0.5 mL，并置于肝素處理過的離心管中。各組采集的血漿樣品以4 000r/min 離心10 min，取上清液，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，代入當日建立的標準曲線中計算各樣品中VEN、ODV、AVA 的質量濃度，再用Origin 9.0 軟件繪制大鼠單獨灌胃給予VEN、VIN及聯合灌胃給予VEN和VIN后血漿中VEN、ODV、AVA的平均血藥濃度-時間曲線。結果見圖4。

2.7 藥代動力學評價將經過方法學驗證的分析方法用于本研究后，采用DAS2.0 軟件計算藥代動力學參數，然后應用SPSS19.0軟件對主要藥代動力學參數即峰濃度（cmax）、消除半衰期（t1/2）、藥時曲線下面積（AUC）、平均駐留時間（MRT）、清除速率（CL/F）、表觀分布容積（Vz/F）進行獨立樣本t 檢驗分析，達峰時間（tmax）采用非參數秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。結果見表3～表5。

由表3～表5 可見，與VEN組比較，VEN+VIN 組大鼠血漿中VEN、ODV 的藥代動力學參數cmax、AUC0 - t、AUC0-∞、MRT0-（t VEN除外）、MRT0-∞（VEN除外）均顯著增大，CL/F、Vz/F 均顯著減小（P<0.05 或P<0.01）。與VIN 組比較，VEN+VIN 組大鼠血漿中AVA的各項藥代動力學參數差異均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

早期相關研究采用熒光法分析VEN及其代謝物[18]，但存在血漿樣品取樣量大、靈敏度不足、分析時間長的問題。鑒于生物樣品成分的復雜性，本研究建立的LC-MS/MS 法可減少干擾，具有專屬、高效、靈敏的特點。為獲得良好的峰形和較高的質譜響應，筆者考察了流動相甲醇、乙腈、水的組成比例，并在水相中加入甲酸來提高離子化程度。結果發現，當流動相為甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（50 ∶45 ∶5，V/V/V）時，VEN、ODV、內標的響應較高、峰形良好，VEN、ODV的保留時間均在1.95 min 內，較文獻[19]中的保留時間更短;當流動相為甲醇-乙腈溶液（85 ∶15，V/V）時，AVA的峰形良好、響應較高且保留時間適宜。

前期研究階段，筆者考察了液液萃取法（萃取劑包括乙酸乙酯、甲基叔丁基醚）和蛋白沉淀法（沉淀劑包括甲醇、乙腈）對VEN、ODV血漿樣品預處理的影響。結果發現，以乙酸乙酯萃取時，VEN、ODV的提取回收率較低;以甲醇和乙腈沉淀蛋白時，VEN、ODV的峰形變寬、柱效較低、重現性差，故采用甲基叔丁基醚作為萃取劑。另外，由于VEN、ODV偏堿性，故在樣品處理時加入碳酸鈉來提高兩者的提取回收率。筆者同樣也考察了液液萃取法（萃取劑包括乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶液）和蛋白沉淀法（沉淀劑包括甲醇、乙腈）對AVA血漿樣品預處理的影響。結果發現，以甲基叔丁基醚、乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶液為萃取劑時，AVA的提取回收率較;以甲醇和乙腈沉淀蛋白時，AVA的峰形變寬、柱效較低、重現性差，故采用乙酸乙酯作為萃取劑。另外，由于AVA偏酸性，故在樣品處理時加入鹽酸來提高AVA的提取回收率

進一步的藥代動力學實驗結果顯示，與VEN 組比較，VEN + VIN 組中VEN、ODV 的藥代動力學參數AUC0-t、AUC0-∞、cmax、MRT0-（t VEN除外）、MRT0-∞（VEN除外）均顯著增大，CL/F、Vz/F均顯著減小，tmax、t1/2差異無統計學意義，提示VIN對VEN、ODV在大鼠體內的藥代動力學行為有影響。與VIN 組比較，VEN+VIN 組中AVA的藥代動力學參數cmax、AUC0-t、AUC0-∞、Vz/F、CL/F、tmax、t1/2、MRT0-t、MRT0-∞差異無統計學意義，提示VEN 對VIN 在大鼠體內的藥代動力學行為并無明顯影響。由此可知，VIN 可增大VEN、ODV的吸收程度，并使兩者的消除減慢，但對兩者的吸收速度無明顯影響。究其原因可能是由于VEN和ODV是經CYP2D6 酶代謝的，而VIN 對CYP2D6 酶有一定的抑制作用，從而減慢VEN、ODV的代謝，造成兩者在體內蓄積。由于VIN 的血管擴張作用可改善腦循環，并增強VEN在中樞神經系統的生物利用度[14]，基于本研究結果筆者推測，VIN可能會導致VEN的中樞神經濃度過高，進而產生不良反應。因此建議在臨床應用過程中，應適當調整VIN 和VEN 聯合用藥的劑量和給藥間隔，并密切關注兩者聯用期間患者的不良反應，以增加治療安全性。

綜上所述，VEN 和VIN 聯用后，VIN 可通過增大VEN、ODV在大鼠體內的吸收程度、減慢兩者消除，影響VEN的代謝。