重組人Dickkopf相關蛋白3在彌漫性大B細胞淋巴瘤患者中的表達及其臨床意義

許京淑，徐奔，向國強，向航

(恩施土家族苗族自治州中心醫院血液病科，湖北 恩施 445000)

臨床上約30%的霍奇金淋巴瘤淋巴瘤為彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1]。DLBCL患者臨床表現特異性小，確診時多為中晚期，嚴重影響治療效果[2]。目前DLBCL主要通過影像學檢查與病理學聯合診斷，但以上技術在判定患者預后方面具有一定局限性。DLBCL患者免疫表型、病理學等特征差異較大，表現為高度異質性，進一步增加了治療的難度[3]。有學者認為DLBCL臨床治愈率較低、預后差，與其缺乏特異性的標志物密切相關[4]。近年來癌癥篩查技術取得了長足發展，其中在乳腺癌、胃癌及結腸癌等腫瘤中發揮重要作用的Wnt信號通路的抑癌因子分泌型蛋白Dickkopf相關蛋白3(Dickkopf-associated protein 3，DKK3)引人關注[5]。在癌細胞中，DKK3基因可調控c-myc以及細胞周期蛋白D1等靶基因，進一步阻滯下游信號通路Wnt而抑制腫瘤侵襲、轉移[6]。研究發現，DKK3低表達是胃癌、乳腺癌等不利的預后因素，因此，鑒定腫瘤組織的DKK3表達水平對判定腫瘤預后可能有一定幫助，而DKK3對DLBCL預后的影響尚缺乏研究依據[7]。本研究主要探討DKK3蛋白水平在DLBCL患者中的變化及其與預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年12月至2019年12月恩施土家族苗族自治州中心醫院收治的56例DLBCL患者，將術中切除的DLBCL組織與癌旁組織作為檢測標本。納入標準：①經病理確診為DLBCL且符合《惡性淋巴瘤診斷治療學》[8]分類標準；②年齡≥18歲；③臨床資料完整；④進行R-CHOP(利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松)方案或R-CHOEP(依托泊苷聯合R-CHOP)方案或多柔比星、長春新堿等化療；⑤生存期預計≥3個月。排除標準：①合并免疫系統疾病、肝腎功能重度異常者；②繼發其他腫瘤；③DLBCL復發者；④失訪者；⑤原發中樞神經系統的DLBCL；⑥精神疾病史及認知障礙者。其中男30例、女26例，年齡29～72歲，平均(53±7)歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；疾病類型：生發中心型42例，非生發中心型14例。本研究獲得恩施土家族苗族自治州中心醫院醫學倫理委員會批準，患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測DKK3蛋白表達 制作組織微陣列蠟塊后切成厚度約4 μm的組織切片，常規脫蠟水化后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，浸入0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液，抗原修復后加入3% H2O2室溫孵育10 min，室溫下羊血清孵育1 h，加濃度為1∶80的一抗DKK3(北京新力生物科技公司生產，批號：ab35847)抗體于4 ℃過夜；次日取出用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二抗工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加以辣根過氧化物酶標記的工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，采用二氨基聯苯氨顯色，純水終止反應，蘇木精復染，返藍、中性樹膠封片[9]。

1.2.2染色結果判定標準 隨機挑選并觀察光學顯微鏡下每張切片的3個高倍視野，采用半定量的方法進行結果判定。著色細胞比例評分：0%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分；染色強度評分：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃褐色為2分[10]?？傇u分=著色細胞比例評分×染色強度評分，總評分≥4分判定為陽性，<4分判定為陰性。

1.3隨訪及預后評價標準 行門診或電話隨訪，隨訪截至2020年12月31日。根據世界衛生組織制訂的療效標準[11]評價術后1年患者的臨床療效。完全緩解：病灶徹底消失；部分緩解：病灶最大直徑減少≥50%，穩定≥1個月；無緩解：病灶未變化或緩解不明顯?？傆行?(完全緩解例數+部分緩解例數)/總例數×100%。在隨訪結束時統計分析中位無進展生存期。

2 結 果

2.1DKK3在DLBCL組織和癌旁組織中的表達 免疫組織化學檢測結果顯示，DLBCL組織中DKK3蛋白陽性表達率明顯低于癌旁組織[42.86%(24/56)比83.93%(47/56)](χ2=7.782，P<0.001)，見圖1。

注：DLBCL為彌漫性大B細胞淋巴瘤，DKK3為Dickkopf相關蛋白3

2.2DLBCL患者DKK3蛋白表達與臨床特征的關系 不同性別、年齡、累及部位、乳酸脫氫酶水平、疾病類型以及有無B癥狀的DKK3陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，但臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的DKK3陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期，國際預后指數評分0～2分的DKK3陽性表達率高于3～4分(P<0.05)。見表1。

表1 DLBCL患者DKK3蛋白表達與臨床特征的關系

2.3DKK3蛋白表達與DLBCL患者預后的關系 術后1年DKK3陽性表達的DLBCL患者的總有效率明顯高于DKK3陰性表達患者[79.17%(19/24)比53.13%(17/32)](χ2=4.051，P=0.044)，DKK3陽性表達的臨床療效優于DKK3陰性表達患者(Z=2.127，P=0.014)，見表2。至隨訪結束，DKK3陽性表達的DLBCL患者中位無進展生存期長于DKK3陰性表達患者[(36±6)個月比(22±4)個月](t=9.775，P<0.001)。

表2 DKK3蛋白表達與DLBCL患者預后的關系 (例)

3 討 論

DLBCL是臨床常見的淋巴瘤類型之一，目前治療主要以化療為主[12]。60%～70%的DLBCL患者使用利妥昔單抗、阿霉素、環磷酰胺、長春新堿和潑尼松等方案可達到較好的治療效果[13]。而部分患者在發病早期即出現遠處轉移，近50%的患者治療后期出現復發，但具體發病機制目前尚不清楚，可能原發于小淋巴細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤等，也可從淋巴結外組織等發展而來[14-15]。研究發現，DLBCL患者化療敏感性、預后與免疫組織分型、細胞學及病理學等密切相關[16]。因此，探討DLBCL發生發展的分子機制及相關蛋白、基因等生物學特征，對進一步提高DLBCL的早期診斷率和改善患者預后尤為必要[17]。

目前，臨床主要通過B超、磁共振成像及CT等影像學技術對DLBCL進行早期診斷，該類技術雖然定位準確但定性難度大?；驑酥疚锉徽J為是一種無創性輔助診斷方法，目前DLBCL仍缺乏特異性檢測指標。此外，影響DLBCL預后的因素較多，同時DLBCL在臨床上有多種分子分型，考慮患者的分子分型與基因異常存在部分重合，任意單一因素變化均可能造成較大影響，提示DLBCL的調控基因復雜且具有顯著異質性[18]。因此，在龐雜的調控基因中準確找到對DLBCL患者診斷與預后有臨床意義的標志物是當前急需解決的問題。

Wnt信號轉導通路可介導調控多種惡性腫瘤的增殖分化過程，其高度活化時可積聚胞質內下游蛋白(β聯蛋白)，使下游蛋白進入細胞核觸發原癌基因轉錄翻譯機制，導致腫瘤細胞異常增殖分化[19]。隨著近年來臨床篩查腫瘤標志物工作的陸續開展，發現潛在腫瘤標志物DKK3具有較好的應用前景，現研究證明其在胃癌、腸癌及輸卵管癌中可作為潛在治療新靶點[20-21]。DKK3基因是經典Wnt信號轉導通路的重要負性調控因子，是一種腫瘤抑制因子，在多種癌癥中低表達，在腫瘤增殖分化中起關鍵作用[22]。DKK3基因高表達可調控c-myc以及細胞周期蛋白D1等靶基因，從而下調下游信號通路Wnt發揮抑制腫瘤侵襲轉移的作用[23]。此外，有研究發現過表達DKK3可通過介導血管內皮生長因子受體2抑制腫瘤血管生成[24]。目前研究發現在多種腫瘤細胞中DKK3基因處于低表達狀態，值得注意的是DKK3基因表達缺失的直接原因為該基因啟動子區的高甲基化，在胃癌組織中腫瘤細胞主要通過高甲基化或啟動子甲基化沉默DKK3基因[25]。當前異常的啟動子甲基化已在生殖系統及消化系統腫瘤DKK3基因中發現，其直接影響患者腫瘤惡性程度及預后，提示DKK3基因可作為腫瘤患者病情判定及評估預后的潛在標志物[26]。目前，有關DKK3基因與DLBCL的相關性研究較少。有研究報道，DKK3蛋白表達水平與卵巢癌患者總生存率呈正相關，且DKK3蛋白表達水平與患者的分期、淋巴轉移、浸潤程度密切相關[27]。

本研究結果顯示，DLBCL組織DKK3陽性率低于癌旁組織(P<0.01)，DLBCL患者DKK3蛋白表達與臨床分期和國際預后指數評分之間存在關聯(P<0.05)，但與性別、年齡、累及部位及乳酸脫氫酶水平不存在顯著性關聯(P>0.05)。Dellinger等[28]研究認為，DKK3啟動子中的甲基化標志著子宮內膜癌預后不良，提示DKK3高表達可能抑制腫瘤組織細胞的分化、增殖及浸潤過程。本研究結果為DKK3蛋白表達水平與其他腫瘤發生發展存在相關性提供了支持。本研究結果同時提示DKK3蛋白陽性表達患者的總有效率高于DKK3蛋白陰性表達(P<0.05)，無進展生存期明顯長于DKK3蛋白陰性表達者(P<0.01)，提示DLBCL患者預后與DKK3表達情況存在關聯，表明DKK3陽性患者術后生存期更長，提示其作為抑癌基因對DLBCL患者預后產生積極影響。以上證據表明，DKK3基因過表達在診斷DLBCL中的潛在價值，DKK3表達增強可能是DLBCL發生發展的重要因素之一。未來對DKK3蛋白不同活化程度的DLBCL患者可采取不同的治療方式，同時做到積極隨訪及密切監測以改善患者預后。

綜上所述，在部分DLBCL患者組織中DKK3陽性表達，且其陽性表達率與患者臨床分期及國際預后指數評分相關，DKK3蛋白陰性表達預示著預后較差，其有望成為DLBCL臨床診斷、治療及判斷預后的新指標。