基于網絡藥理學預測芹菜素治療系統性紅斑狼瘡的機制

樂純琰 楊國蓉 傅杭杰 高天問 丁 濱 季巾君

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復雜的自身免疫性疾病，臨床表現廣泛，從輕度皮疹到血液異常、腎損傷和神經精神受累等，其具體發病機制尚不清楚，一般認為與遺傳、內分泌、免疫和環境因素（如飲食、藥物、感染）等有關[1]。我國約有超過100 萬SLE 患者，其中女性患者高達113/10 萬人，且該數據呈現逐年上升的趨勢[2]。全基因關聯研究確定了50 多個與SLE 相關的基因位點，特別是涉及免疫調節途徑的基因，其中包括干擾素調節因子5（IRF5）、信號轉導子和轉錄激活因子（STAT）、白細胞介素10（IL-10）等[3]。大量研究表明，STAT 信號通路在SLE 中表達異常，STAT 蛋白被絲氨酸磷酸化后可進一步參與其他重要途徑，如p38/MAPK 途徑、mTOR 途徑、蛋白激酶R 途徑等[4]，而未磷酸化的STAT 也可以通過其他轉錄因子，如NF-κB 的相互作用參與其他基因的表達[5]。

根據《金匱要略》中升麻鱉甲湯研制而成的解毒祛瘀滋陰方已廣泛用于SLE 的臨床治療，且療效明顯，主要成分之一的積雪草被證實有活血祛瘀的功效[6]。芹菜素是一種廣泛分布于水果、蔬菜和中草藥的天然黃酮類化合物，這類化合物作為自由基清除劑和抗氧化劑，表現出抗氧化、抗炎和抗癌的作用；能夠抑制細胞周期，減少氧化應激，誘導凋亡，刺激免疫系統，影響包括p38/MAPK、PI3K/Akt 和NF-κB通路，在抗炎和免疫調節中有很好的應用[7]。因此我們推測積雪草中的芹菜素可能在治療SLE 中發揮一定作用。但目前對于芹菜素治療SLE 的研究尚未見報道，因此，本研究通過網絡藥理學的方法，利用多個數據庫預測了芹菜素和SLE 的潛在靶點，并通過基因功能基因功能（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析研究芹菜素治療SLE 的可能機制，研究流程圖如圖1 所示。

圖1 基于網絡藥理學的研究流程圖

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 材料：人腎上皮細胞（293T 細胞）購自中國科學院上海細胞庫；pERα-Luc、pERβ-Luc、pNF-κB-Luc 及相應表達載體flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）、Renilla 為實驗室備存；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司（貨號：E195A）；芹菜素購自上海源葉生物科技有限公司（貨號：S31423-1g）。

試劑：DMEM 培養液（貨號：SH30285.02）、胎牛血清（貨號：SH30088.03）購自Hyclone 公司；脂多糖（LPS）（貨號：L2880-10MG）、β-雌二醇（β-E2）（貨號：E110145-1g）、二甲基亞砜（DMSO）（貨號：D8418-50ML）購自美國Sigma 公司；SuperFectinTMⅡIn Vitro DNA Transfection Reagent 購自上海普飛生物有限公司（貨號：2102-100）。

1.2 儀器與設備 超凈工作臺[蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-1F（D）/2FCD]；水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）；CO2培養箱（日本三洋公司，型號：MCO-5M）；多功能酶標儀（賽默飛世爾科技公司，型號：5200110）。

1.3 實驗方法

1.3.1 芹菜素靶點的篩選 利用NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）輸入化合物名稱，下載芹菜素的2D 結構，導入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）及PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數據庫，預測出芹菜素的潛在靶點，借助Uniprot 蛋白質數據庫（https://www.uniprot.org/）對篩選的蛋白質靶點進行矯正規范。

1.3.2 SLE 靶點篩選 以“systemic lupus erythematosus”為關鍵詞輸入OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）及PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）數據庫檢索，整理刪除重復項后即得到疾病相關靶點。

1.3.3 芹菜素-SLE 共同靶點篩選及“疾病-靶點-化合物”網絡構建 將芹菜素和SLE 的靶點輸入Venny2.1在線作圖平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，兩者交集即為芹菜素和SLE 的共同靶點，并運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“疾病-靶點-化合物”網絡圖。

1.3.4 芹菜素-SLE 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建及核心靶點的篩選 將篩選得到的共同靶點上傳至STRING 在線數據庫（https://www.stringdb.org/），設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲得芹菜素-SLE 的蛋白互作關系，并將蛋白質相互作用關系下載為TSV 格式，利用Cytoscape 3.8.2 將其可視化為PPI 網絡，進行共同基因的分析及核心靶點的篩選。

1.3.5 芹菜素-SLE 基因功能及通路富集分析 將共同靶點上傳到DAVID 數據庫中（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進行GO 富集分析，基于R4.1.1軟件用Bioconductor 生物信息軟件包進行KEGG 通路富集分析，對芹菜素-SLE 共同靶點進行生物學功能及主要信號通路分析，將結果以條形圖或氣泡圖形式輸出。在本研究中，P＜0.05 被認為差異具有統計學意義。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證篩選的主要信號通路 293T 細胞鋪48 孔板，將pERα-Luc、pERβ-Luc 和pNF-κB-Luc 熒光素酶報告基因質粒分別與相應 的表達載 體flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）和內參質粒Renilla 共同轉染24 h后，pERα-Luc 和pERβ-Luc 用β-E2（20 μg/mL）刺激，pNF-κB-Luc 用LPS（1 mM）刺激18 h 后收集細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測。本研究采用GraphPad Prism 8.3 軟件對所得數據進行單因素方差分析，以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芹菜素-SLE 共同靶點的篩選及作用靶點網絡的構建 將通過NCBI 數據庫獲得的芹菜素2D 結構導入相應數據庫，共預測出芹菜素潛在靶點77 個（見表1）。同時以“systemic lupus erythematosus”為關鍵詞，篩選得到SLE 潛在靶點1016 個，韋恩圖中取交集后獲得共同基因21 個。將共同靶點導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，繪制出芹菜素-SLE-靶點相互作用網絡，圖中藍色三角形代表21 個共同靶點，綠色錐形代表疾病，橙色菱形代表芹菜素（見圖2）。

表1 芹菜素靶點信息

圖2 芹菜素-SLE-靶點作用網絡

2.2 PPI 網絡構建及核心靶點的篩選 PPI 網絡是通過上傳21 個共同靶點到STRING 數據庫，并以Confidence score＞0.4 和人類為條件篩選得到有關系的蛋白，并通過Cytoscape 軟件將蛋白之間的相互關系進行可視化處理，獲得了一個具有18 個節點，44條邊的PPI 網絡圖（如圖3）。在該網絡圖中，核心度較高的靶點用較大的節點和較亮的顏色表示，相關度較強的靶點邊緣用較粗和較亮的線表示。選擇核心度最大的3 個靶點作為芹菜素治療SLE 的核心靶點：ALB、HSP90AA1 和ESR1。

圖3 芹菜素治療SLE 的PPI 網絡

2.3 靶點富集通路分析 首先，將21 個芹菜素-SLE 共同靶點上傳到DAVID 數據庫進行GO 富集分析，包括生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個部分。GO 數據分析共富集到37 條生物學功能、12 條細胞組成過程和26 條分子功能過程，以P＜0.05 和基因富集程度為篩選條件，分別選出前十的結果進行分析（如圖4）。

圖4 芹菜素-SLE 共同靶點的GO 生物學過程富集分析

再將21 個芹菜素-SLE 共同靶點經R 語言運行后進行KEGG 通路分析，共得到12 條KEGG 通路，分別為精氨酸和脯氨酸代謝通路（arginine and proline metabolism）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、苯丙氨酸代謝通路（phenylalanine metabolism）、組氨酸代謝通路（histidine metabolism）、化學致癌作用-受體激活（chemical carcinogenesisreceptor activation）、NF-κB 信號通路（NF-κB signaling pathway）、冠狀病毒病-COVID-19（coronavirus disease -COVID -19）、血清素突觸（serotonergic synapse）、血小板活化（platelet activation）、酪氨酸代謝通路（tyrosine metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路（glycine，serine and threonine metabolism）、色氨酸代謝通路（tryptophan metabolism）。根據P 值，將12 條通路進行數據可視化分析，形成氣泡圖（見圖5）。

圖5 芹菜素-SLE 共同靶點的KEGG 代謝通路富集分析

2.4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證篩選的主要信號通路 雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，芹菜素能夠抑制由β-E2 激活的ERα 和ERβ 的轉錄，其中對ERβ 的影響極顯著（P＜0.01）（見圖6A、B）；同時，芹菜素能夠顯著抑制由LPS 誘導的NF-κB 轉錄（P＜0.05）（見圖6C）。芹菜素的抑制活性表現出劑量依賴，但趨勢不明顯（P＞0.05）。

圖6 不同濃度芹菜素對ERα（A）、ERβ（B）、NF-κB（C）轉錄活力的影響

3 討論

SLE 是一種涉及多器官、多系統的炎癥性自身免疫性疾病，發病機制尚不明確[1]，目前臨床上的常用藥有激素和免疫抑制劑等，但不良反應較大[6]。解毒祛瘀滋陰方以生地黃為君藥，加以升麻、白花蛇舌草、薏苡仁、積雪草為臣藥，增強清熱解毒之功，再加以其他佐藥和使藥，起到滋陰益腎、清熱解毒之效，在降低激素的毒副作用、緩解患者病情、改善體力和疲勞程度、促進生理和心理康復、提高生存質量方面大有裨益[6]。然而，中藥復方由于活性成分復雜、作用靶點多樣，闡明其藥理作用機制的研究進展緩慢。網絡藥理學為化合物與疾病作用關系靶點和機制的研究提供了一個很好的平臺，為后續實驗的開展和創新提供了新的思路和理論基礎。

本研究基于網絡藥理學篩選到了77 個芹菜素潛在靶點和1016 個SLE 疾病靶點，兩者交集得到21 個芹菜素-SLE 共同靶點，其中TOP 前三為ALB、HSP90AA1 和ESR1。ALB 能調節凝血功能，降低炎癥因子毒性，臨床研究發現SLE 患者體內ALB 水平顯著降低，推測可能與機體過度免疫有關[8]。HSP90是分子伴侶蛋白，參與炎癥相關免疫過程，能促進各種促炎細胞因子和抗原相互作用；HSP90AA1 是HSP90 的家族成員之一，通過調控編碼HSP90α 蛋白，參與機體的免疫和炎癥反應[9]。雌激素已被證明在SLE 的發生發展中通過細胞內的ERα 發揮重要作用，ERα 由基因ESR1 編碼。ESR1 的多態性與SLE 的易感性顯著相關，并且雌激素的部分代謝物介導了SLE 風險的增加[10]。此外，ESR1 可以調節含三聯基序的蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM-21）的表達，從而抑制SLE 中細胞因子的產生[11]。從網絡藥理學研究來看，芹菜素對ESR1表現出良好的靶向作用，這可能是治療SLE 的機制之一，抑制ESR1 可能成為未來治療SLE 的新方向。

通路富集結果顯示，共富集到12 條通路，所有通路的P 值均小于0.05，其中最為顯著的是雌激素信號通路和NF-κB 信號通路。ESR1 和ESR2 編碼ERα 和ERβ 亞型，兩者不僅可以通過直接結合雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）調節基因轉錄，還可以通過與其他轉錄因子相互作用來調節基因轉錄[11]。雌激素受體還可能與NF-κB 相互作用，引起DNA 上NF-κB 結合位點的調節，從而調節NF-κB 依賴的基因轉錄。雌激素受體以細胞類型特異性調節NF-κB 介導的基因表達，并在炎癥過程中具有重要意義[12]。NF-κB 有助于骨髓中B 細胞和胸腺中T 細胞的成熟，在免疫系統發育中起著至關重要的作用，但是B 細胞和T 細胞的過度表達和失調都會導致SLE[13]。此外，NF-κB 信號通路還與腫瘤相關信號通路共同作用，參與機體免疫調節、炎癥反應等生理過程，因此芹菜素可能通過參與雌激素信號通路、NF-κB 信號通路等多條通路在SLE 的治療中發揮作用。

基于上述網絡藥理學的預測，對雌激素信號通路和NF-κB 信號通路進行雙熒光素酶報告基因檢測，結果顯示芹菜素能夠抑制ERα，并且顯著抑制ERβ 和NF-κB 的轉錄。由于SLE 的發生較為復雜，轉錄活力的下降只是芹菜素治療SLE 活性的初步驗證，對其他通路及下游炎癥因子的調控和表達的改善作用還需要進一步實驗驗證。

綜上可見，芹菜素作為解毒祛瘀滋陰方中的一個活性化合物，可以調控多個與SLE 發病相關的生物學過程，ALB、HSP90AA1、ESR1 是3 個關鍵靶點，調控雌激素信號通路、NF-κB 信號通路等12 條相關信號通路，為展開相關的實驗研究提供了方向。